Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes (стр. 1 )

На правах рукописи

СИСТЕМА АНАЛИЗА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ

ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ

LISTERIA MONOCYTOGENES

03.02.03. – микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва

2010 год

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН (г. Владивосток) и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика РАМН (г. Москва)

Научные консультанты:

Академик РАМН,

доктор медицинских наук,

профессор

Доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, д. м.н., профессор

Член-корр. РАМН, д. м.н., профессор

Доктор медицинских наук

Ведущая организация:

ФГУН «Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

Защита состоится «___»_________2010 г. в 11__ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 в НИИЭМ им. РАМН ( 8)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ им. РАМН

Автореферат разослан «__»_______ 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

д. м.н., профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Последние 20 лет характеризуются существенным увеличением интереса ученых и клиницистов к листериозной инфекции. Он обусловлен многочисленными эпидемическими вспышками листериоза в развитых странах (Франция, США, Германия, Испания и т. д.), связанными с употреблением в пищу продуктов, контаминированных листериями. В то время как до 1980-х годов листериоз был относительно редкой инфекцией, регистрируемой преимущественно среди людей, связанных с животноводством, в настоящее время он является одной из ведущих пищевых инфекций в Европе и Америке с летальностью до 20-40% (ВОЗ, 1988, Farber J. M., Peterkin P. I., 1991). Причины подобного изменения эпидемической ситуации до сих пор остаются до конца невыясненными. Отчасти, увеличение заболеваемости листериозом связано с длительным хранением пищевых продуктов при низкой температуре, что способствует размножению в них листерий при первично слабой контаминации ими. С другой стороны, нельзя исключать возможности изменения свойств штаммов листерий, циркулирующих в окружающей среде и представляющих опасность для человека.

В Российской Федерации заболеваемость листериозом у людей регистрируется с 1991 г. (, 2001, и др., 2002). Однако официальная статистика (40-100 случаев в год) не отражает реального состояния заболеваемости листериозом, что обусловлено не только разнообразием клинических форм болезни, но также недостаточной осведомленностью врачей об особенностях проявления этой инфекции и нехваткой недорогих отечественных селективно-дифференцирующих сред и тест-систем для ее лабораторной диагностики.

Наряду с этим проблема листериоза становится все более актуальной в связи с увеличением случаев заражения его возбудителем людей со сниженным Т-клеточным звеном иммунитета. Одним из важных остается вопрос о распространении листериозной инфекции у беременных женщин, в связи с возможностью внутриутробного инфицирования плода, часто сопровождающегося абортами, мертворождениями и высокой летальностью среди новорожденных.

Основная масса эпидемических вспышек пищевого листериоза, зарегистрированных начиная с 1982 г., связана с этиологическим значением относительно узкой филогенетической группы внутри вида Listeria monocytogenes, характеризующейся принадлежностью к серогруппам 4b (около 90% эпидемических случаев), 1/2a и 1/2b. Однако до сих пор неизвестно, какие именно свойства эпидемических штаммов L.monocytogenes обусловливают их высокую опасность. Остаются невыясненными биологические особенности L.monocytogenes, обитающих в разных экологических условиях. Особый интерес представляет вопрос о патогенных свойствах листерий, выделяемых из продуктов питания и объектов окружающей среды.

Практически отсутствуют работы, в которых была бы отражена характеристика листерий, обитающих в природе, а также дано сравнение их с эпидемически значимыми штаммами, что в настоящее время представляется важным ввиду возможности заноса высоковирулентных штаммов L.monocytogenes в окружение человека из природных очагов.

Решение перечисленных вопросов, связанных с биологией и вирулентностью возбудителя листериоза, а также с закономерностями эпидемического процесса этой инфекции, может быть осуществлено на основе микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга за возбудителем с применением эффективных методов диагностики и созданием современных систем для типирования штаммов листерий. Все вышесказанное определило направление исследований, предпринятых в данной работе.

Цель работы: разработать систему микробиологических и молекулярно-генетических маркеров, позволяющую выявлять высоковирулентные штаммы L. monocytogenes, необходимую для контроля распространения листериозной инфекции.

Задачи исследования:

1.  Разработать комплекс методов и средств для выделения и идентификации бактерий рода Listeria из различных источников окружающей среды, получить коллекцию дальневосточных штаммов листерий.

2.  Дать характеристику микробиологических свойств и патогенного потенциала штаммов L.monocytogenes, изолированных из различных источников в Дальневосточном регионе России, и провести их сравнительный анализ со штаммами L.monocytogenes, выделенными в Европейской части России. В экспериментальных условиях установить влияние абиотических факторов на вирулентность штаммов L.monocytogenes.

3.  Изучить молекулярно-генетические особенности штаммов L.monocytogenes, выделенных из различных объектов на Дальнем Востоке и в Европейской части России, и дать оценку их эпидемологической значимости.

4.  Выявить генетические маркеры, характерные для эпидемически значимых штаммов L.monocytogenes.

5.  На основе особенностей генетического полиморфизма штаммов разработать систему типирования L. monocytogenes и дать филогенетическую характеристику бактерий вида L.monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке Российской Федерации.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

·  Выявлено генетическое разнообразие бактерий рода Listeria, распространенных на Дальнем Востоке Российской Федерации, в том числе патогенного вида L.monocytogenes. Показано преобладание в данном регионе сероварианта 4b, опасного в эпидемическом плане для людей. Создана коллекция дальневосточных штаммов бактерий рода Listeria.

·  Впервые доказано, что, несмотря на сходство морфологических, культуральных и биохимических свойств, штаммы L.monocytogenes из дальневосточной и европейской частей РФ могут быть дифференцированы с помощью методов молекулярно-генетического типирования. Установлены существование регион-специфического распределения штаммов L.monocytogenes на территории РФ, а также поликлональность распределения штаммов этого вида внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).

·  Впервые в сравнительном аспекте изучены гены, кодирующие факторы адгезии и инвазии - белки семейства интерналинов (inlA, inlB, inlC, inlE, inlG, inlH, inlF), белки ActA, Auto у штаммов L. monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России из различных источников. Определены последовательности генов inlA, inlB, inlC, inlE, prs у штаммов L.monocytogenes, часть из которых (345 фрагментов) депонированы в базу данных международного GenBank.

·  Установлено, что штаммы L.monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, включая человека, имеют гены inlA, inlB, inlC, inlE, независимо от региона выделения; гены inlF, inlG, inlH являются штаммоспецифическими.

·  Впервые установлена корреляция между развитием внутриутробной инфекции и аллелем фрагмента генов inlA и inlC, кодирующего функционально-значимый домен (LRR-домен) факторов инвазии InlA и InlC, у штаммов L.monocytogenes. Высказано предположение о том, что развитие внутриутробной листериозной инфекции плода у беременных женщин может быть связано с определенными вариантами белков InlA и InlC возбудителя. Получены свидетельства значимости генов inlA и inlC как маркеров штаммов L.monocytogenes, представляющих повышенную опасность для развития листериоза у плода.

·  Впервые показано, что выявленные среди диких грызунов и морских гидробионтов штаммы L.monocytogenes могут обусловливать внутриутробную инфекцию у человека, что предполагает возможность заноса вирулентных штаммов L.monocytogenes из окружающей среды в антропогенные системы.

·  Выявлено изменение адгезивных свойств бактерий рода Listeria, включая вид L. monocytogenes различных серовариантов, под влиянием температуры, кислотности среды (рН) и экзогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Установлено, что при температуре 4-80С, рН = 6,0 и 8,0 повышаются, а при температуре 370С и рН = 9,0 снижаются адгезивные свойства L. monocytogenes.

Теоретическая значимость работы определяется тем, что впервые в сравнительном аспекте представлена комплексная характеристика микробиологических и молекулярно-генетических особенностей бактерий вида L.monocytogenes, выделенных из различных объектов на территории Дальнего Востока и Европейской части России. Установлены молекулярно-генетические маркеры, характеризующие высоковирулентные штаммы L.monocytogenes. Полученные результаты имеют фундаментальное значение для микробиологии и эпидемиологии, поскольку расширяют представление о патогенных бактериях рода Listeria, распространенных на территории Российской Федерации, а также дополняют и уточняют знания о развитии инфекционного процесса при листериозной инфекции.

Практическая значимость работы

·  Предложена модифицированная схема выделения и идентификации листерий с использованием сконструированных для этих целей запатентованных дифференциально-диагностической среды для листерий, комплексной индикаторной среды для дифференциации бактерий рода Listeria, питательной среды на основе молок лососевых рыб (жидкой, сухой и плотной) для культивирования бактерий. Создана коллекция дальневосточных штаммов бактерий рода Listeria. Разработанные среды и диагностические методы рекомендованы для проведения мониторинга за возбудителем листериоза в бактериологических лабораториях санитарно-эпидемиологического и ветеринарного надзора, а также в лечебно-профилактических, научно-исследовательских и учебных учреждениях как для целей диагностики инфекционных заболеваний человека и животных, так и для целей сертификации продуктов питания.

·  Предложен оригинальный метод генетического типирования изолятов L.monocytogenes на основании последовательностей фрагментов генов inlA, inlB, inlC, inlE и prs, позволяющий дифференцировать эпидемически несвязанные изоляты листерий с индексом дискриминации 0,982.

·  На основе полимеразной цепной реакции разработан способ детекции специфических для L.monocytogenes генов, кодирующих белки-интерналины (inlA, inlB, inlC, inlE). Результаты комплексного изучения генов, кодирующих белки-интерналины, могут служить базой для анализа принадлежности штаммов листерий к определенной филогенетической линии и для оценки их эпидемиологической значимости.

·  Установлен спектр антимикробных препаратов, к которым резистентны штаммы L.monocytogenes, выделенные на Дальнем Востоке, что позволяет совершенствовать рациональную схему этиотропной терапии листериоза у больных.

·  Полученные результаты микробиологических и молекулярно-генетических исследований могут быть использованы в исследованиях при изучении факторов патогенности L.monocytogenes, а также при создании новых диагностических и терапевтических препаратов.

·  Депонированные в GenBank нуклеотидные последовательности штаммов L.monocytogenes имеют значение при проведении научных исследований, поскольку они могут быть использованы при типировании вновь выделенных штаммов L.monocytogenes, а также для уточнения данных об их происхождении и для установления связи различных генетических вариантов с течением и проявлениями листериозной инфекции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.  Существует полиморфизм факторов инвазии - семейства белков-интерналинов - у L.monocytogenes, основного возбудителя листериоза. Все культуры L.monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, независимо от региона изоляции, обладают генами inlA, inlB, inlE, inlC.

2.  Молекулярно-генетическое типирование L. monocytogenes на основании полиморфизма генов inlA, inlB, inlE, inlC и prs позволяет дифференцировать филогенетически удаленные штаммы, штаммы, циркулирующие в географически удаленных областях, а также эпидемически несвязанные между собой изоляты листерий.

3.  Для L. monocytogenes, выделенных на территории РФ, характерны регион-специфическое распределение штаммов и поликлональность распределения штаммов внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).

4.  Имеется связь между филогенетическим положением штамма L.monocytogenes и его эпидемиологическим потенциалом. Среди L. monocytogenes из клинического материала, от грызунов и морских гидробионтов преобладают штаммы листерий, относящиеся к первой филогенетической линии; среди L. monocytogenes из продуктов питания доминируют штаммы, относящиеся ко второй филогенетической линии.

5.  Эпидемически значимые штаммы L.monocytogenes, вызывающие внутриутробную листериозную инфекцию плода у человека, распространены в объектах окружающей среды в Дальневосточном регионе, в том числе среди диких грызунов, морских гидробионтов и в пищевых продуктах, реализуемых в торговой сети.

6.  Выявлена корреляция между нуклеотидной последовательностью аллелей генов, кодирующих определенные факторы инвазии, и частотой выделения несущих эти последовательности штаммов L.monocytogenes от разных хозяев.

Материалы диссертации были использованы при подготовке:

1.  Информационно-методического письма «По правилам взятия, доставки, методам лабораторных исследований материала от больного с подозрением на ООИ, сроки выдачи результатов» авторов , , Зайцевой и одобрено Лабораторным советом ФГУ ЦГСЭН в Приморском крае (Решение № 1 от 25.04.02.). Владивосток. – 2002.

2.  Методических рекомендаций «Лабораторная диагностика листериоза» авторов , , . Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. – 2006.

3.  Информационного письма «Listeria monocytogenes – новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов» авторов , , . Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. – 2006.

4.  Методического пособия для бактериологов «Питательные среды для изоляции, типирования и идентификации бактерий рода Listeria» авторов , , . Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. – 2008.

5.  Патента № 000 Российской Федерации. Дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий / , , / Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 2.11.1999. Опубл. 10.07.2002.

6.  Патента № 000 Российской Федерации. Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода Listeria /, , / Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 28.12.2005. Опубл. 20.07.2007.

7.  Заявки на изобретение № /13 (012634) МПК7 C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04. «Питательная среда для культивирования бактерий» /, , /Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 26.03.2008.

8.  Заявки на изобретение № МПК7 C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04 «Питательная среда для культивирования бактерий (ее варианты)» /, , /Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 4.08.2008.

Апробация материалов диссертационной работы:

Основные положения диссертации были представлены на конгрессах и конференциях международного, российского и регионального уровня: II Дальневосточном конгрессе «Человек и лекарство» с международным участием (Владивосток, 2005); Всероссийском конгрессе «Оптимальное питание – здоровье нации»: к 75-летию Государственного учреждения Научно-исследовательского института питания РАМН (Москва, 2005); Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» («Сосновка», Новосиб. обл., 2005); III Российской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); 13 международном конгрессе по приполярной медицине (Новосибирск, 2006); 11th International Symposium on Microbial Ecology (Вена, Австрия, 2006); 2nd FEMS Congress of European Microbiologists (Madrid, Spain, 2006); 16th International Symposium on Problems of Listeriosis. ISOPOL XVI (Savannah, Georgia, США, 2007); 9th Symposium on Bacterial Genetics and Ecology (Wernigerode, Германия, 2007); 5th World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases (Bangkok, Thailand, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007»; Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); 4 международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (Санкт-Петербург, 2008); научно-практической конференции с международным участием «Роль вирусных и бактериальных инфекций в формировании перинатальной и соматической патологии у детей» (Хабаровск, 2008).

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 62 научных публикациях, в том числе: 6 – в международной печати, 18 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, а также в 3 информационных письмах, 2 патентах на изобретение, 2 заявках на изобретение, 1 пособии для бактериологов, 1 методических рекомендациях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и практическое здравоохранение, списка использованной литературы. Работа изложена на 312 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу, 36 рисунков. Список цитированной литературы включает 459 источников, из которых – 121 отечественных и 338 - иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования проведены на базе лаборатории экологии патогенных бактерий НИИЭМ СО РАМН (г. Владивосток). Отдельные фрагменты молекулярно-генетических исследований выполнены на базе лаборатории экологии возбудителей инфекций в НИИЭМ им. РАМН (г. Москва).

Все экспериментальные и клинические исследования проведены с разрешения Комитета по биомедицинской этике НИИЭМ СО РАМН (протокол /2 от 01.01.01 г.).

Микроорганизмы. В работе использованы типовые штаммы (21 штамм) бактерий рода Listeria – L.monocytogenes (серовариантов 1/2а, 1/2b, 1/2c, 3a, 4a, 4b, 4c, 4d, 7), L.ivanovii NCTC 11846, L.innocua SLCC 3379, L.seeligeri SLCC 5921, L.welschimeri, L.grayi 17, полученные из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. РАМН (г. Москва) и музея Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВМиВ, г. Покров), а также изоляты листерий (289 изолятов), выделенные из клинического материала, животных, объектов окружающей среды (почва, вода, пищевые продукты) на Дальнем Востоке (238 изолятов) и в Европейской части (51 изолят) Российской Федерации.

При выполнении ряда экспериментальных исследований использовали штаммы Escherihia coli 284, Staphylococcus aureus 192, Yersinia pseudotuberculosis 222, Y. pseudotuberculosis 2781, Y. enterocolitica 2012, Y. enterocolitica 164, Shigella flexneri 73, Salmonella enteritidis 285, S. typhimurium 5369, S.paratyphi 286 из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.

В экспериментах по изучению адгезивных свойств листериозного микроба использовали нативные эритроциты человека О (I) Rh (+) группы крови.

В ряде исследований применяли низкомолекулярную дезоксирибонуклеиновую кислоту (нДНК) - вещество, полученное учеными ТИНРО - Центра, защищенное патентом (г. Владивосток, патент СССР № 000). Низкомолекулярная ДНК представляет собой аморфный порошок светло-кремового цвета, растворимый в воде при нагревании и нерастворимый в органических растворителях. В состав нДНК входит 79,0% ДНК, 7,8% белка, 2,1% липидов и 10,7% воды. Молекулярная масса нДНК составляет 270 – 500 кДа.

Лабораторные животные. Экспериментальная часть работы выполнена на неинбредных мышах массойг, морских свинках весом г, кроликах массой 1,5 - 2 кг, полученных из питомника РАМН «Столбовая». Работа выполнена с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. Разброс животных в группе по массе не превышал ± 10%. В каждой опытной группе было от 5 до 10 животных. Животные контрольных и опытных групп были одного пола, возраста, получены из питомника одновременно. Животных выводили из опыта с использованием эфирного наркоза.

Методы. Морфологические, культуральные и биохимические исследования проводили по общепринятым методам, описанным в справочниках по микробиологическим и вирусологическим методам исследования (, 1982, , 1978, , 1986, и др.,1997), а также согласно методов, сред, рекомендованных ГОСТ Р и МУК 4.2.1122-02 для выделения листерий.

Антигенные свойства культур определяли в линейной реакции агглютинации с типовой поливалентной и моновалентных (I и II серотипов) листериозных сывороток и с использованием набора бактериофагов, включающий фаги L-2A и L-4A, по методике предложенной изготовителем (ВНИИВВиМ, г. Покров).

Антибиотикорезистентность штаммов листерий изучали методом диско-диффузии в агар согласно МУК 4.2.1890-04.

Определение адгезивной активности листерий проводили по методу с соавт. (1996).

Вирулентность культур определяли на белых неинбредных мышах (самцах), массой 14-18 г, которых заражали внутрибрюшинно десятикратно возрастающими дозами (от 10 до 109 микробных клеток), с вычислением LD50 и ее доверительного интервала при помощи метода Кербера (, , 1962), средней продолжительности жизни (СПЖ) ( и др., 1997) а также по керато-конъюнктивальной пробе на морских свинках.

Молекулярно-генетические методы. В работе использовали олигонуклеотидные праймеры, синтезированные фирмой «Синтол» (Москва). Праймеры, ограничивающие фрагменты изучаемых генов, были выбраны в 5’ и 3’ областях открытых рамок считывания (ОРФ) с помощью программы Oligo38. Для проведения ПЦР использовали бактериальные лизаты, приготовленные из суточных культур листерий, как описано с соавт. (2003).

Идентификацию выделенных листерий до вида L.monocytogenes проводили c помощью тест-системы АмплиСенс Listeria monocytogenes (, г. Москва) методом ПЦР по программе фирмы-изготовителя, и с помощью видоспецифических для L.monocytogenes праймеров plc1 – plc2,и lmp1 – lmp2 ( и др., 2001; 2003).

Определение принадлежности выделенных культур к бактериям рода Listeria проводили методом амплификации ДНК бактерий при помощи ПЦР с праймерами для определения гена prs, кодирующего родоспецифический белок общего метаболизма - фосфорибозилпирофосфатсинтазу (, , 2003).

Серогруппоспецифические маркерные гены выявляли с помощью мультиплекс-ПЦР метода, предложенного M. Doumith и соавт. (2004).

Определение генов, кодирующих белки-интерналины (InlА, InlВ, InlС, InlE, InlG, InlH, InlF), и генов, кодирующих белки Auto и ActA, осуществляли с использованием в ПЦР праймеров, которые были выбраны на основе последовательностей генов, полученных из базы данных ListiList (http://www. pasteur. fr), содержащей последовательность генома штамма EGD-e (положительного контроля). ПЦР осуществляли по программам, которые были подобраны экспериментально для каждой пары праймеров. Продукты ПЦР анализировали методом гель-электрофореза в 1% агарозе (Sigma).

Подготовка образцов для секвенирования. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки - интерналины А, В, С, Е (inlA, inlB, inlC, inlE) и гена prs были получены из базы данных ListiList (http://www. pasteur. fr). Концентрацию ампликонов проверяли путем электрофореза на агарозном геле в сравнении со стандартным маркером (1 kb DNA Ladder, «Fermentas»). Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью набора GFXtm PCR DNA and Gel Band Purification Kit («Amersham», Англия).

Секвенирование фрагментов ДНК проводили в Институте молекулярной биологии им. РАН в Центре коллективного пользования «Геном» (г. Москва). Последовательности, полученные в результате секвенирования, были прочитаны с помощью программы Chromas v.1.45 (CopyrightÓ Conor McCarthy, http://www. . au/chromas. html). Множественное выстраивание последовательностей было осуществлено с помощью программы ClustalW 1.83.XP (Thompson J. D. et al., 1994). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием пакета программ DnaSP version 4.10 (Rozas J. et al.,2003). Построение дендрограмм было осуществлено с помощью программы Mega version 3.1 (Kumar S. et al., 2004). Индекс дискриминации (D. I.) вычисляли, как предложено (Hunter P. R., Gaston M. A., 1988).

Нуклеотидные последовательности (345 последовательностей) штаммов L.monocytogenes были депонированы в GenBank.

Статистическую обработку материала осуществляли с использованием общепринятых параметрических критериев (, , 1962, 1999). В работе были использованы методы корреляционного и регрессионного анализов ( 1999), расчеты произведены с использованием программы электронных таблиц Excel - 4.1 на компьютере типа IBM-PC, Pentium IV.

Для выявления различий между данными опытных и контрольных групп применяли t-критерий Стьюдента. В работе использованы известные графические приемы выражения статистических данных (, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Биологические свойства листерий, изолированных на Дальнем Востоке

Подбор оптимальных питательных сред, схемы выделения, культивирования и изучения биологических свойств листерий. В начале работы были подобраны оптимальные питательные среды для изоляции и культивирования листерий, ингибиторы для приготовления селективной дифференциальной среды (патент РФ № 000), разработана индикаторная среда (патент РФ № 000) с целью эффективного выделения культур из разнообразных объектов окружающей среды, клинического материала, а также модифицированы среды для изучения свойств листерий - определение подвижности, ДНКазной и липазной активности, биохимических свойств. Наилучшие результаты при определении подвижности отмечались при посеве культур листерий на полужидкий 0,3%-ный агар с 2,3,5-трифенилтетразолием хлористым (ТТХ). Из-за высокой чувствительности и наглядности предпочтение в практической работе, возможно, следует отдать этой среде.

Отработана оптимальная схема исследования различных проб для выделения листерий. В результате сформирована коллекция дальневосточных культур листерий, включающая 238 изолятов.

В ходе исследований выявлено, что на Дальнем Востоке выделяются разнообразные виды бактерий рода Listeria – L.monocytogenes (47,1% от общего числа изолятов), L. innocua (19,7%), L.seeligeri (2,9%), L.ivanovii (1,2%), L.welschimeri (0,8%). Эти бактерии были обнаружены в различных объектах окружающей среды – в речной воде, наземных растениях, водорослях, изолированы из органов грызунов, морских гидробионтов, клинического материала, пищевых продуктов (мясных, молочных, рыбных, мясе птицы), а также из смывов с оборудования на производственных предприятиях.

Выявлена контаминация патогенными L. monocytogenes продуктов питания в 6,3% исследованных образцов. Чаще всего патогенный вид L.monocytogenes выделяли из мясных (12,7% от числа исследованных образцов), куриных (2,9%) и рыбных (1,6%) продуктов. Наряду с L.monocytogenes (2,8%), часто пищевые продукты были контаминированы и бактериями вида L.innocua (2,7 %), особенно мясные (13,3% от числа исследованных образцов; отечественного и импортного производства), овощи (8,1%), реже рыбные (1,2%).

Cреди биотических объектов в Дальневосточном регионе России патогенный вид L.monocytogenes обнаружили у мышевидных грызунов рода Apodemus (52,6% от общего числа изолятов, полученных от грызунов; полевая и восточно-азиатская мыши), лесных полевок рода Myodes (47,4%; красная и красно-серая полевки), серой крысы, морских гидробионтов (1,4%; морской гребешок, морская звезда, морской еж, камбала). Среди обследованных грызунов, отловленных на территории края, по числу инфицированных патогенным для человека и животных видом L.monocytogenes доминировала полевая мышь (Ap. agrarius), обитающая на равнинной территории Приморского края. Было также зафиксировано выделение L.monocytogenes из воды и ила реки Кневичи. Полученные результаты свидетельствуют о существовании на Дальнем Востоке РФ патогенных бактерий L.monocytogenes в естественных экосистемах.

Следствием широкого распространения листерий в природе явилось выделение возбудителя от людей (из абортированных плодов, клинического материала от беременных женщин, плацент, трупного материала от больного, умершего от листериозного менингита).

Обращает на себя внимание выделение из биологических объектов на территории Дальнего Востока и других видов листерий - L.ivanovii (0,1% от числа изолятов), L.innocua (0,2%), L.seeligeri (0,3%). Эти микроорганизмы обнаружены в пробах из органов грызунов (0,3%), морских гидробионтов (0,4%).

Сравнительный анализ микробиологических свойств L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России. Для решения вопроса о стабильности или изменчивости микробиологических свойств листерий, изолированных в различных регионах России, коллекции культур L. monocytogenes, выделенных в Дальневосточном регионе и Европейской части России, были исследованы по культурально-биологическим и ферментативным свойствам.

Для обеих коллекций отмечена стабильность биологических свойств листерий – типичный рост колоний на питательных средах с характерным кисломолочным запахом, при нормальном освещении колонии имеют голубовато-серый цвет, характерное голубое или голубовато-зеленое свечение в косо-проходящем свете, наличие каталазной и гемолитической активности, подвижность при 20-220С и ее отсутствие у большинства культур при 370С, отсутствие оксидазной активности.

У культур L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России, не было найдено выраженных отличий и по биохимическим свойствам. Все культуры L.monocytogenes независимо от их происхождения сбраживали с образованием кислоты – глюкозу, фруктозу, рамнозу, эскулин, мальтозу, салицин и не ферментировали ксилозу, раффинозу, мочевину, маннит, адонит.

Вариабельные результаты в зависимости от региона выделения листерии показали по отношению к мелецитозе, арабинозе, крахмалу, образованию ацетилметилкарбинола в реакциях с метиловым красным и Фогес-Проскауэра (табл. 1). Культуры L.monocytogenes, выделенные на Дальнем Востоке в большинстве ферментировали мелецитозу, арабинозу, крахмал и образовывали ацетилметилкарбинол, по сравнению с культурами листерий из Европейской части России.