Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes (стр. 4 )

Важно отметить, что были выявлены два сиквенс-типа, к которым принадлежали как клинические изоляты, так и изоляты, полученные из дикой природы. Так, к СТ1 принадлежали культуры L.monocytogenes, выделенные от мертворожденных плодов, из окружающей среды и грызунов. К сиквенс-типу 17 принадлежали культуры L.monocytogenes, выделенные от морских гидробионтов, из морепродуктов из торговой сети и от мертворожденных. Полученные данные свидетельствуют о распространении в природных очагах штаммов L. monocytogenes, высоковирулентных для человека.

Для более детального выявления характеристик, которые могли быть специфическими для культур, выделенных из конкретных источников, мы установили частоту встречаемости определенных аллелей для каждого из генов в зависимости от источника выделения. В результате, впервые нами была обнаружена корреляция между источником выделения L.monocytogenes и аллелем генов инвазии (табл.10).

Таблица 10

Оценка достоверности неравномерного распределения аллелей генов

у штаммов L.monocytogenes, связанных с определенным видом хозяина

Группа	χ2 тест Пирсона	Тест рандомизации
p < 0,01	p<0,05	p<0,01	p<0,05
«МП»	inlA inlC	inlB	inlA inlC
«H»		inlB
«Г»	inlB			inlB
«МГ»	inlA inlC inlE			inlA inlC inlE
«П»		inlB

Примечание: «МП» – изоляты L.monocytogenes из мертворожденных плодов, «Н» – изоляты L.monocytogenes от носителей, «Г» – изоляты L.monocytogenes от грызунов, «МГ» – изоляты L.monocytogenes из морских гидробионтов, «П» – изоляты L.monocytogenes из объектов окружающей среды, пищевых продуктов, млекопитающих, кроме грызунов из группы «Г».

Анализ частоты встречаемости аллелей отдельных генов, кодирующих интерналины, у штаммов L.monocytogenes, изолированных от различных организмов, показал статистически достоверную неравномерность распределения аллелей некоторых генов у изолятов, полученных от конкретного хозяина (табл. 10). Для генов inlA и inlC специфические аллели преобладали среди культур L.monocytogenes, выделенных из мертворожденных плодов (группа «МП», аллели 1 и 5 для inlA, 1 и 6 для inlС); аллель 1 гена inlB преобладал среди культур, выделенных от грызунов (группа «Г»), но не других хозяев. В группе контроля (изоляты из пищевых продуктов, «П») все аллели изучаемых генов были распределены равномерно. Аллели гена prs были распределены однородно во всех группах.

Полученные данные позволяют предположить, что развитие внутриутробной листериозной инфекции у беременных женщин может быть связано с определенными аллелями генов inlA и inlC. Кроме того, полученные нами результаты свидетельствуют о значимости генов inlA и inlC как маркеров штаммов L. monocytogenes, представляющих повышенную опасность для беременных женщин в развитии листериоза у плода.

Отмеченное низкое генетическое разнообразие аллелей генов inlA, inlC и inlE у изолятов L.monocytogenes, полученных из морских гидробионтов на Дальнем Востоке России, предполагает, что эти изоляты могли быть потомством одного клона. В то же время они отличались по аллелям гена inlB, что предполагает отсутствие предпочтения аллелей гена inlB в возникновении инфекции у данной группы хозяев.

Таким образом, наши результаты предполагают распространенность специфических аллелей генов, кодирующих интерналины у культур L.monocytogenes, инфицирующих определенного хозяина. Наличие несинонимичных замен у генов, кодирующих интерналины, свидетельствует о возможности селективного отбора, в результате которого могут отбираться варианты, более адаптированные для выживания в определенных условиях и, поскольку интерналины принадлежат к факторам патогенности, для паразитирования в определенных хозяевах.

ВЫВОДЫ

1.  Создана комплексная система анализа микробиологических и молекулярно-генетических свойств возбудителя листериоза, L.monocytogenes, включающая: (1) оригинальные селективные и дифференциальные питательные среды на основе отечественного сырья; (2) адаптированные и оптимизированные для отечественных условий методы микробиологической дифференциации; (3) экспресс-методы выявления и идентификации возбудителя листериоза, основанные на ПЦР, специфичной в отношении консервативных фрагментов генов патогенности; (4) систему типирования L.monocytogenes на основе мультилокусного секвенирования генов факторов патогенности, позволяющую дифференцировать эпидемически несвязанные между собой изоляты листерий с индексом дискриминации 0,982.

2.  Впервые дана комплексная характеристика бактерий вида L.monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке РФ; показано преобладание в этом регионе штаммов вида L.monocytogenes, относящихся к эпидемически значимому сероварианту 4b.

3.  Впервые доказано, что, несмотря на сходство морфологических, культуральных и биохимических свойств, дальневосточные и европейские штаммы L.monocytogenes могут быть дифференцированы с помощью методов молекулярно-генетического типирования. Установлены существование регион-специфического распределения штаммов L. monocytogenes на территории РФ, а также поликлональность распределения штаммов L. monocytogenes внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).

4.  Впервые установлена филогенетическая структура L. monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке. Подтверждено существование двух филогенетических линий внутри вида L.monocytogenes. Установлена связь между филогенетическим положением штамма L. monocytogenes и его эпидемиологическим потенциалом. Впервые показано, что среди изолятов L. monocytogenes из клинического материала, от грызунов и морских гидробионтов преобладают штаммы листерий, относящиеся к первой филогенетической линии; среди изолятов L. monocytogenes из продуктов питания доминируют штаммы, относящиеся ко второй филогенетической линии.

5.  Впервые показано, что штаммы L. monocytogenes, распространенные в природе среди мышевидных грызунов и среди морских гидробионтов, вызывают внутриутробную инфекцию у человека. Это подтверждает предположение о возможности заноса вирулентных штаммов L. monocytogenes из окружающей среды в человеческую популяцию.

6.  Показано существование у L.monocytogenes штаммоспецифического полиморфизма спектра факторов инвазии - белков семейства интерналинов. Определено, что все культуры L.monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, независимо от региона изоляции, обладают генами inlA, inlB, inlE, inlC. Впервые установлено, что ген, кодирующий белок InlF, проявляет вариабельность в размере и последовательности нуклеотидов у L.monocytogenes, выделенных из разных источников; показано, что гены inlG и inlH не выявляются у большинства штаммов L.monocytogenes, изолированных из организма человека и животных. Эти данные свидетельствуют о том, что кодируемые этими генами белки InlG и InlH не являются необходимыми для возникновения листериозной инфекции.

7.  Впервые установлена корреляция между последовательностью определенных аллелей генов, кодирующих факторы инвазии, и частотой выделения штамма L. monocytogenes от разных хозяев. Среди штаммов, вызывающих развитие внутриутробной инфекции у человека, преобладают определенные аллели гена inlA, и гена inlC, кодирующих факторы инвазии InlA и InlC. Среди штаммов L. monocytogenes, выделенных от мышевидных грызунов, доминируют определенные аллели гена inlB, кодирующего функциональный домен фактора инвазии InlB.

8.  Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности фрагментов генов inlA, inlB, inlC, inlE и prs показал значимость LRR-кодирующего фрагмента генов inlA и inlC, как маркера штаммов L.monocytogenes, представляющих повышенную эпидемиологическую опасность для развития листериоза у плода.

9.  Впервые комплексно определено влияние абиотических факторов среды на адгезивные свойства листерий. Установлено значение температуры, кислотности среды и экзогенных нуклеиновых кислот в изменении адгезивных свойств листериозного микроба, что может воздействовать на инициацию инфекционного процесса.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ:

- в науку:

1.  Использование метода мультилокусного секвенирования при типировании L. monocytogenes на основании полиморфизма генов интерналинов и гена prs позволит дифференцировать филогенетически удаленные штаммы листерий и штаммы, циркулирующие в географически удаленных областях, а также эпидемически несвязанные изоляты, что поможет решать задачи микробиологии и эпидемиологии.

2.  Полученные нуклеотидные последовательности генов инвазии inlA, inlB, inlC inlE и гена общего метаболизма prs, депонированные в базе данных Международного GenBank, могут служить стандартами для исследования геномного полиморфизма штаммов L.monocytogenes в научных целях.

- в медицинскую практику:

1. Для здравоохранения разработана система микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга за возбудителем листериоза, что позволит проводить систематический анализ и прогнозирование заболеваемости этой инфекцией. Начиная с 2002 г. на базе лаборатории экологии патогенных бактерий НИИЭМ СО РАМН осуществляется мониторинг за возбудителем листериоза в Приморском крае и г. Владивостоке.

2. Для накопления культур возбудителей сапрозоонозов, включая бактерии рода Listeria, рекомендовано использовать питательные среды на основе молок дальневосточных рыб, которые обеспечивают активное размножение микробов (заявка на изобретение № от 01.01.2001 г. «Питательная среда для культивирования бактерий»; заявка на изобретение № от 4.08.2008 «Питательная среда для культивирования бактерий (ее варианты)»). Предложенные питательные среды (жидкие, агаризованные, в т. ч. сухие) предназначены для культивирования различных бактерий, обладают хорошими ростовыми свойствами и накопительным эффектом. Данные среды просты и экономичны в изготовлении, легко могут быть освоены на производстве и приготовлены в бактериологической лаборатории. Использование отходов рыбного производства – молок рыб различной стадии зрелости, в том числе текучих, позволяет расширить отечественную сырьевую базу для приготовления питательных бактериологических сред.

3. Для контроля за инфицированностью листериями пищевых продуктов и объектов окружающей среды рекомендовано использовать дифференциально-диагностическую среду (патент РФ № 000 от 01.01.2001 г. «Дифференциально-диагностическая среда для листерий»). Предложенная селективная среда не уступает по своим качествам известным селективно-дифференциальным средам для выделения листерий.

4. На начальных этапах бактериологического исследования рекомендовано использовать комплексную индикаторную среду для дифференциации бактерий рода Listeria (патент РФ № 000 от 01.01.2001 г. «Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода Listeria»), которая позволяет в первые 18-24 ч удалить посторонние микроорганизмы. Это сокращает использование дорогостоящих сред и реактивов, ускоряет процесс идентификации листерий в сравнительно короткие сроки, что значительно упрощает работу врача-бактериолога (методическое пособие «Питательные среды для изоляции, типирования и идентификации бактерий рода Listeria» /авторы , , . Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.- 2008).

5. Предприятиям, деятельность которых связана с пищевой продукцией, в том числе пищеблокам различных учреждений, рекомендовано усилить меры по профилактике листериоза (информационное письмо «Listeria monocytogenes - новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов» / авторы , , . Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.- 2006).

6. Бактериологическим лабораториям, осуществляющим диагностику инфекционных заболеваний, рекомендовано активизировать работу по изоляции патогенного вида L.monocytogenes из клинического материала и пищевых продуктов (методические рекомендации «Лабораторная диагностика листериоза» / авторы , , . Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток; методическое пособие «Питательные среды для изоляции, типирования и идентификации бактерий рода Listeria» / авторы , , . Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.- 2008).

- в учебный процесс:

Материалы диссертации рекомендовано использовать при преподавании курса медицинской микробиологии, экологии бактерий, эпидемиологии, инфекционных болезней.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. , , , Сомов механизмы адаптации Listeria monocytogenes к факторам окружающей среды // Листериоз на рубеже тысячелетий: материалы межд. конференции. Покров, 18-20 мая 1999 г. С

2. , , О существовании патогенных бактерий в окружающей среде // Вестник ДВО РАН. 2000. № 3. С. 3 – 9.

3. , Терехова -эпидемические особенности Listeria monocytogenes в Приморском крае // Тихоокеанский мед. журнал. Спец. выпуск. 2001. №2. С

4. , , и др. Изоляция Listeria monocytogenes из различных объектов в Приморском крае и их биологические свойства // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. № 1. С.

5. , , и др. Окраинные моря северо-западной части Тихого океана как среда обитания Listeria monocytogenes и эпидемиологическое значение этого явления // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. №1. С. 43 – 46.

6. , , , Сомов -диагностическая среда для выделения листерий /Патент № 000 Российской Федерации. Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 2.11.1999. Опубл. 10.07.2002.

7. А. Распространение бактерий рода Listeria на территории Приморского края // Ветеринарная патология. 2004. Т 4, № 11. С. 28 – 31.

8. Зайцева чувствительности к антимикробным препаратам штаммов Listeria monocytogenes, выделенных в Приморском крае. // Антибиотики и химиотерапия. 2005. Т. 50. № 7. С.

9. , Сомов полимеразной цепной реакции для идентификации бактерий Listeria monocytogenes // Генодиагностика инфекционных болезней: материалы Российской научно-практической конференции. «Сосновка», Новосиб. обл., 25-27 октября 2005. С.

10. , , и др. Влияние ДНК из молок лососевых рыб на Т-клеточный иммунитет в эксперименте // Антибиотики и химиотерапия. 2005. № С.

11. О контаминации пищевых продуктов Listeria monocytogenes в Приморском крае // Оптимальное питание – здоровье нации: материалы VIII Всерос. Конгресса к 75-летию Государственного учреждения Науч.-исслед. инст. питания РАМН. Москва, 2005. С. 97.

12. , Сомов характеристика Listeria monocytogenes, изолированных из различных источников в Приморском крае // Журн. микробиол. 2006. № 2. С

13. , Сомов температуры на адгезивные свойства листерий // Журн. микробиол., Приложение. 2006. № 3. С.

14. , , Беседнова ДНК из молок лососевых рыб на адгезивные свойства Listeria monocytogenes и выживаемость белых мышей при экспериментальном листериозе // Журн. микробиол., Приложение. 2006. № 3. С.

15. , , .Изучение эффективности применения биологически активного вещества ДНК из молок лососевых рыб при экспериментальном листериозе // Журн. микробиол., Приложение. 2006. № 3. С. 65 – 68.

16. Зайцева Е. А., , , Listeria monocytogenes – новый микробиологический показатель безопасности пищевых продуктов // Мясная индустрия. 2006. № 4. С. 30-32.

17. , А, Сомов , кодирующие факторы инвазии у штаммов Listeria monocytogenes, изолированных в Европейской части и Дальневосточном регионе России // Журн. микробиол. 2006. № 4. С.

18. , , и др. Эпидемиологическая значимость Listeria monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе из клинического материала // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: материалы III Российская научно-практическая конференция с международным участием. Новосибирск, 27-29 сентября 2006 г. С. 192–193.

19. Zaytseva E. A., Ermolaeva S. A., Somov G. P. Genes coding invasion factors in Listeria monocytogenes strains isolated from macroorganisms on the Russian Far East // 2nd FEMS Congress of European Microbiologists: abstr. Madrid, Spain. 5-8 Jule, 2006. P. 134.

20. Zaytseva E., Ermolaeva S., Somov G. Genes coding invasion factors in Listeria monocytogenes strains isolated on the Russian Far East // 11th International Symposium on Microbial Ecology: abstr. Vienna, Аustria, 20-25 August 2006. P. 442.

21. , , Глазырина диагностика листериоза: методические рекомендации. Владивосток. 20с.

22. , , Сомов , кодирующие факторы инвазии, у штаммов Listeria monocytogenes, изолированных из пищевых продуктов // Бюллетень СО РАМН. Приложение: материалы конференции. Новосибирск, 12-16 июня, 2006. С.231-232.

23. , , и др. Молекулярно-генетические особенности и эпидемиологическая значимость штаммов Listeria monocytogenes, выделенных от беременных женщин и из абортного материала в дальневосточном регионе России // Клин. микробиол., антимикроб. химиотер. 2007. Т. 9. № 1. С.81-89.

24. Zaytseva E. A., Ermolaeva S. A., Somov G. P. Phylogenetic features of Listeria monocytogenes clinical strains isolated on the Russian Far East // 16th International Symposium on Problems of Listeriosis. ISOPOL XVI: abstr. Savannah, Georgia, USA. March 20-23, 2007. P-16.

25. Zaytseva E. A. , Ermolaeva S. A., Somov G. P. SNP analysis of the virulence gene inlB and the housekeeping gene prs in Listeria monocytogenes isolated in the Far East of Russia // 9th Symposium on Bacterial Genetics and Ecology – Bageco-9: abstr. Wernigerode, Germany. 23-27 June 2007. P. 82.

26. Zaytseva E. A., Pukhovskaya N. M., Musatov Y. S., Ivanov L. I., Ermolaeva S. A., Somov G. P. Genetic diversity and epidemiological significance of Listeria monocytogenes from pregnant women and aborted fetuses on the Russian Far East // 5thWorld Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases: abstr. Bangkok, Thailand. November 15-18, 2007. P. 51.

27. , , Ермолаева мониторинг за листериозной инфекцией в очаге ГЛПС на территории Приморского края // Молекулярная диагностика – 2007: материалы 6-ой Всероссийской научно-практической конф. с межд. участием. М., 2007. Т. 2. С. 298–299.

28. Zaytseva E., Ermolaeva S., Somov G. P. Low genetic diversity and epidemiological significance of Listeria monocytogenes isolated from wild animals in the Far East of Russia // Infect. Genet. Evol. 2007. Vol. 7, No. 6. P. 736-742.

29. А., , Сомов индикаторная среда для дифференциации бактерий рода Listeria / Патент № 000 Российской Федерации. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 28.12.2005. Опубл. 20.07.2007.

30. , , Гордеец Listeria monocytogenes у больных с клиникой инфекционного мононуклеоза // Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний: материалы Всероссийской научной конференции. Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. № 2 (22). Приложение, Часть I. С. 225–226.

31. , , Сомов особенности L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке России // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: материалы 4 межд. конф. Санкт-Петербургиюня 2008 г. С. 147.

32. , , Сомов Listeria monocytogenes среди мышевидных грызунов на территории Приморского края // Тихоокеанский мед. журнал. 2008. № 2. С.

33. , , и др. Питательные среды для выделения, типирования и идентификации бактерий рода Listeria: методическое пособие для бактериологов. Владивосток. 20с

34. , , и др. Дифференциация штаммов Listeria monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России, на основе полиморфизма генов, кодирующих факторы инвазии // Журн. микробиол. 2008. № 6. С. 10 – 14.

35. , , , Сомов среда на основе молок рыб для культивирования бактерий // Известия ТИНРО. 2009. Т. 157. С. 229-236.

36. , , Сомов метод дифференциации бактерий рода Listeria // Клиническая лабораторная диагностика. 2009. № 6. С