Совершенствование селекционного процесса плодовых и ягодных растений на основе цитологических методов и культуры изолированных тканей (стр. 3 )

Контроль ризогенеза у побегов осуществляли введением в питательную среду ИМК (1,0-5,0мг/л). На этапе укоренения более эффективным оказалось добавление 5,0мг/л ИМК. Частота формирования придаточных корней составила 21,7-47,8%. Для стимулирования корнеобразования нами изучено влияние на этот процесс контрастных температурных факторов, путем воздействия на побеги, находящиеся на питательной среде ризогенеза с ИМК (1,0мг/л). В результате отмечена определенная тенденция одноразового и двухразового воздействия контрастными температурами на увеличение укореняемости побегов. Разработанный прием контроля ризогенеза довольно прост, не требует дорогостоящего оборудования и экономит регуляторы роста группы ауксинов. Следовательно, прорастание пазушных почек у зародышей и развитие дополнительных побегов может быть вызвано введением в среду препарата из группы цитокининов (6-БАП 1,0-4,0мг/л), что способствует тиражированию побегов, увеличению выхода однородных сеянцев и сохранению ценных генотипов, в частности при проведении работ по отдаленной гибридизации.

Глава 5. Регенерация растений in vitro и применение культуры тканей в селекции земляники.

Для селекционных целей рекомендуется следующая схема использования тканевых культур:

1.  Индукция и культивирование каллусной ткани из эксплантов различного происхождения.

2.  Морфогенез адвентивных побегов из каллуса.

3.  Регенерация придаточных побегов непосредственно из исходных эксплантов.

4.  Тиражирование и укоренение побегов-регенерантов в условиях in vitro.

5.  Перенос пробирочных растений в почвенный субстрат и адаптация к новым условиям произрастания.

6.  Выращивание растений-регенерантов в открытом грунте, их анализ и отбор ценных в селекционном отношении форм.

5.1. Индукция и культивирование каллусной ткани, анатомические и ультраструктурные особенности клеток каллуса. В результате проведенных экспериментов были получены линии каллусных культур на средах с широким диапазоном гормонального состава. Установлено, что для индукции каллуса в достаточном количестве и улучшения его морфологических показателей использования сред с 2,4-Д в соответствующей концентрации (1,0 – 2,0 мг/л) или её сочетание с ИУК и кинетином (2:1:1) является более эффективным. Для меристематических клеток каллуса характерно наличие в центре активно увеличенного в размере ядра, фибриллярной структуры ядрышек, мелких вакуолей и электронно-плотной цитоплазмы. В каллусных тканях морфогенез осуществлялся по типу стеблевого (адвентивного) органогенеза.

5.2. Морфегенез адвентивного морфогенеза из каллуса. У растений, полученных из каллусных культур, возрастает вероятность появления генетических изменений на уровне качественных и количественных признаков (сомаклональная изменчивость), что имеет принципиально важное значение для селекционных исследований с привлечением тканевых технологий. Однако при этом возникает немало трудностей и главная из них – проблема индукции морфогенеза при регенерации. Гормональный баланс питательной среды является ключевым фактором, способствующим реализации морфогенетического потенциала тканей к регенерации. В качестве индукторов стеблевого органогенеза применяли регуляторы роста цитокининовой и ауксиновой природы в различных концентрациях и сочетаниях. Отобранные варианты питательных сред, на которых происходило лучшее развитие побегов показали, что наибольшая частота регенерации характерна для вариантов с включением 5,0 и 10,0мг/л 6-БАП в сочетании с 0,5мг/л ИМК (сорт Урожайная ЦГЛ) или ИУК (сорт Фейерверк). Менее интенсивно при этом сочетании регуляторов роста протекает процесс регенерации у сорта Рубиновый кулон (частота регенерации менее 5%), но замена ИМК и ИУК на 2,4-Д (0,5мг/л) повышает морфогенетическую способность каллуса до 53,6%. Установлено, что существенное влияние на регенерацию из каллуса оказывает сортовая специфика исходного экспланта, но при обязательном присутствии в среде 6-БАП.

Таблица 4 - Стеблевой органогенез в культуре каллусных тканей 4-5 пассажей (регенерационная среда по прописи Мурасиге-Скуга, в среднем за гг.)

Вариант среды с регуляторами роста, мг/л	Фейерверк	Урожайная ЦГЛ
% регенерации	поб./экспл., шт.	% регенерации	поб./экспл., шт.
6-БАП 2,0 +2,4-Д 0,1	47,8	2,9	29,2	2,3
6-БАП 5,0 + ИМК 0,5	60,0	2,3	64,0	2,1
6-БАП 10 + ИУК 0,5	56,5	2,5	35,7	1,3

Варианты сред с установленным оптимальным составом экзогенных регуляторов роста показали положительные результаты по получению адвентивных побегов из каллуса, возраст которого составлял 140-160 суток (4-5 пассаж), (с ростом числа пассажей снижается регенерационная способность) (табл.4).

В процессе работы были модифицированы стандартные условия культивирования тканей за счет использования предварительного выращивания каллусных культур на регенерационной среде в темноте при экспозиции 3 недели и t=23±2 0С (табл.5).

Таблица 5 - Реакция каллуса на способность к регенерации

при предварительном культивировании в темноте

(среда Мурасиге – Скуга, 6-БАП 5,0мг/л + ИМК 0,5мг/л, в среднем за гг.)

Сорт	t=23±2 0C, 16-ч фотопериод (контроль)	t=23±2 0C, темнота 3 недели	НСР05
% регенерации	поб./экспл., шт.	% регенерации	поб./экспл., шт.
Урожайная ЦГЛ	60,0±8,9	2,1	80,0±7,3	3,6	0,77
Фейерверк	57,1±9,0	2,3	76,9±7,8	3,9	1,07
Холидей	26,6±8,1	1,8	40,0±8,9	2,5	0,8
Консервная плотная	46,7±9,1	1,4	55,2±9,1	1,9	0,48

Представленные в таблице 5 данные показывают, что изменение основных параметров светового режима влияло на стеблевой органогенез и этот прием является достаточно эффективным, позволяющий повысить частоту регенерации до 80% (сорт Урожайная ЦГЛ), а у трудноразмножаемого генотипа до 40% (сорт Холидей). Установлено, что при двухразовом воздействии контрастных температур морфогенетический потенциал каллусов увеличивается в 1,5 - 2 раза. Считаем, что разработанные методические подходы повышения регенерации в каллусных тканях могут быть использованы для других представителей вида F. ananassa Duch с целью повышения эффективности и направленности селекционного процесса земляники.

5.3. Регенерация придаточных побегов непосредственно из исходных эксплантов. Установлено, что листовые диски способны регенерировать побеги на средах с различными добавками регуляторов роста разной частотой. Было выделены варианты сред, которые обеспечивали, больший процент заложения и развития побегов. Физиологическое свойство 6-БАП вызывать заложение почек на листовых дисках более ярко проявлялась при взаимодействии 2,4 – Д или ИУК в соотношении 20:1. Отмечена зависимость частоты регенерации от соотношения цитокинин : ауксин в среде. По мере уменьшения разницы в соотношении снижался показатель потенции к регенерации. Регенерационная способность зависела от генотипических особенностей сорта. Ориентация листовых дисков на поверхности среды (адаксиальной или абаксиальной поверхностью) не оказывает существенного влияния на индукцию адвентивных побегов.

Световой режим культивирования является важным внешним фактором, который оказывает влияние на процесс регенерации. Изменения стандартных условий культивирования за счет введения этапа предварительного содержания листовых дисков в темноте позволяет увеличить частоту регенерации (табл.6).

Следовательно, разработанные приемы по стимуляции адвентивного органогенеза (с учетом влияния генотипа, гормонального состава, физических условий культивирования, ориентации экспланта) позволяет повысить регенерационную способность листовых эксплантов до 40-75%, а также среднее число побегов на эксплантов (2,5-5,7 шт.).

Таблица 6 - Влияние предварительного культивирования листовых дисков в темноте на регенерацию (среда Мурасиге – Скуга)

Сорт	16 часовой фотопериод, t=23±20С (контроль)	Темнота 3 недели, t=23±20С
% регенерации	поб./экспл., шт	% регенерации	поб./экспл., шт
Фейерверк	37,8	2,5	75,0	5,7
Урожайная ЦГЛ	31,8	2,1	63,0	5,2
Рубиновый кулон	20,8	1,9	42,6	2,8
Консервная плотная	23,3	2,3	42,9	2,5
Холидей	19,5	2,1	40,0	2,6

Примечание. Листовые диски сорта Холидей культивировали на среде с 6-БАП (10 мг/л) +ИУК (0,5 мг/л), сортов отечественной селекции – с 6-БАП (10 мг/л) + 2,4-Д (0,5 мг/л).

5.4. Тиражирование и укоренение побегов, полученных в культуре каллусных и листовых тканей. Применяя отработанные приемы, размножения в системе in vitro были получены идентичные копии в количестве, необходимом для исследований. Коэффициент размножения на среде Мурасиге-Скуга с 6-БАП 1,0мг/л составлял в зависимости от сорта 4,7-8,3 шт. В качестве индуктора ризогенеза предпочтительнее использовать ИМК 0,5мг/л. Всего было получено 4423 растения, из них: сорта Фейерверк – 2048 шт., сорта Урожайная ЦГЛ – 1171 шт., сорта Рубиновый кулон – 727 шт., сорта Консервная плотная – 232 шт., сорта Холидей – 245 шт.

Оптимизированы отдельные элементов технологии ускоренного размножения in vitro перспективных сортов земляники. Так, установлена реакция генотипов на состав компонентов индукционной среды при пролиферации пазушных почек. Для этого использовали варианты сред по прописям: Мурасиге-Скуга, ½ Мурасиге-Скуга, Андерсона, Ли-Фасарда, Готре, Хеллера. При крупномасштабном производстве посадочного материала вполне пригодна среда Мурасиге-Скуга. Способность к развитию дополнительных побегов апексами зависела от концентрации в среде форм азота (табл.7). Снижение исходной концентрации NH4 NO3 в 2-8 раз не влияет на коэффициент размножения и соответствует контролю. Уменьшение содержания KNO3 существенно снижает пролиферацию побегов. Полученные данные можно рекомедовать для практической работы.

Таблица 7 - Влияние концентрации различных форм азота на рост и

развитие пазушных побегов сорта Мариева Махераух

(среда Мурасиге-Скуга, 6-БАП 1 мг/л, 1 пассаж, гг.)

№ опыта	Азотные соединения, мг/л	Количество побегов, шт.	Длина побегов, см	Количество листьев, шт.
I	NH4NO3 1650 (контроль)	4,3	3,5	12,2
825	4,3	3,2	12,2
412,5	3,9	3,2	12,1
206,25	3,8	3,2	10,3
II	KNO3 1900 (контроль)	5,5	2,8	-
950	2,0	2,1	-
475	1,7	1,8	-
237,5	1,3	1,6	-
	НСР05	1,3	0,8

Примечание. 1 опыт - уменьшена концентрация только NH4NO3,

2 опыт - только KNO3.

Большое значение для культивируемых верхушек побегов играет продолжительность светового дня. При продолжительности фотопериода 16 часов, коэффициент размножения выше, чем при 8 и 12-часовом световом дне. Проведенное изучение методических вопросов, направленных на повышение показателей развития корневой системы (длина и количество корней), путем затемнения питательной среды ризогенеза нейтральным веществом – метиленовой синью показало, что лучшие результаты наблюдались у всех генотипов при использовании в концентрации 0,05%.

У растений, сформированных in vitro следует адаптировать к росту в полевых условиях, как корневую систему, так и надземную часть. Эти мероприятия следует проводить в теплицах, что снижает трудоемкость процесса и сокращает сроки получения полноценной рассады, способной к росту in vitro. Размещать растения в теплице рекомендуется при схеме 7 х 7см. Улучшение качества тумана в теплице можно достичь за счет уменьшения диаметра отверстия распылителя до 0,7мм и повышения давления в системе до 4 атм. Эти приемы позволили повысить выход адаптированных растений из теплицы до 85-90%.

Оценка экономической эффективности выращивания рассады земляники с использованием клонального микроразмножения свидетельствует о высокой доходности (в ценах 2003г.). Выход рассады с 1 га маточника увеличился по сравнению с обычной технологией на 355 тыс. шт. или на 98,6%. Полные затраты на 1 га возросли в 2,8 раза, а денежная выручка в 4 раза. В связи с тем, что темпы роста выручки выше, чем темпы роста затрат прибыль с 1 га маточных насаждений увеличилась в 5,2 раза и составила 1361,9 тыс. руб. при уровне рентабельности 173,9%. По сравнению с обычной технологией выращивания рассады прибыль на 1 руб. затрат выросла на 81 коп. или 87,2%.