Совершенствование селекционного процесса плодовых и ягодных растений на основе цитологических методов и культуры изолированных тканей (стр. 5 )

Глава 6. Регенерация растений in vitro и применение культуры тканей в селекции малины

6.1. Клональное микроразмножение сортов-доноров источников эксплантов. Отбор исходных эксплантов с растений, произрастающих in vitro имеет свои преимущества, т. к. исключается техническая работа по поверхностной стерилизации материала и растительные ткани не повреждаются. Исследователь может проводить эксперименты с тканевыми культурами в течение всего года, независимо от вегетационного периода растений. Исследования показали, что тип почек не оказывает влияние на характер роста и развития эксплантов in vitro. В результате культивирования в пазухах розеток листьев формируются дополнительные почки, из которых развиваются побеги. Процесс пролиферации почек и побегов наиболее интенсивно протекает на среде Андерсона, обогащенной 6-БАП в концентрации 1мг/л (табл. 9).

Таблица 9 - Формирование дополнительных побегов в культуре изолированных апексов (среда Андерсона, 6-БАП 1,0 мг/л, 1992 г.)

Сорт	Коэффициент размножения побегов, шт.
1-й пассаж	2-й пассаж	3-й пассаж	4-й пассаж
Карнавал	4,1	6,1	14,7	26,6
Комета	3,2	5,0	11,4	23,5
Кумберленд	2,3	4,6	7,8	15,2
Новость Кузьмина	2,1	4,2	6,0	10,5
Молинг промис	2,1	4,0	5,5	11,1

Количество развившихся микропобегов зависело от числа проведенных субкультивирований. Так, коэффициент размножения сорта Карнавал особенно возрастал в третьем и четвертом пассажах и в среднем достигал 14,7-26,6 побегов. При этом наблюдаются сортовые различия в способности формировать дополнительные побеги. Добавление 0,5мг/л ИМК в среду Андерсона с уменьшенным в 2 раза количеством минеральных солей и содержанием 20г/л глюкозы, обеспечивает наиболее высокий уровень укореняемости побегов-регенерантов. Частота корнеобразования составляет 72-92% и, в основном, зависит от генотипа. Анализ данных свидетельствует о важной роли генотипа, как наиболее значимого фактора при клональном микроразмножении.

6.2. Индукция и культивирование каллусной ткани, цитогенетические особенности клеток каллуса. Культуральными средами были агаризованные питательные среды по прописи Мурасиге-Скуга или Андерсона. Индукция каллуса более успешно осуществлялась в присутствии 2,4-Д оптимальная концентрация, которой составляла 4,0мг/л. Уровень каллусообразования у сортов: Карнавал, Молинг промис, Новость Кузьмина, Комета составил соответственно – 72%, 84%, 100%, 100%. Не установлено влияние на каллусогенез типа исходного экспланта (листовых дисков и черешков) и стандартных составов используемых питательных сред. Полученная культура каллусной ткани, в основном, светло-желтого или белого цвета и имеет глобулярную средне-плотную консистенцию. Однако на среде с добавлением 6,0мг/л 2,4-Д часто формируется каллус с очень плотной структурой и глянцевой поверхностью, что особенно характерно для сорта Молинг промис. При анатомическом изучении подобной каллусной ткани отмечается заложение элементов ксилемы или флоэмы. Это, видимо, влияет на частоту регенерации побегов этого сорта. Индукция каллусообразования зависит от используемых генотипов. Для эксплантов характерны сортовые различия на присутствие в среде регуляторов роста с ауксиновой активностью или их сочетание с низкими концентрациями цитокинина. При высоких концентрациях может снижаться уровень образования каллуса (за счет формирования корней) и его морфологические показатели.

Цитологический анализ выявил генетическую вариабельность клеток 45-50 суточного каллуса. При анализе клеток были обнаружены кариологические изменения (в норме 2n=14), которые выражались в формировании гаплоидных (n=7), тетраплоидных (4n=28) и анеуплоидных (2n-1=13, 2n+1=15, 2n+2=16) клеток. Одной из причин возникновения аномальных кариотипов, являлось нарушение нормального процесса митоза под действием различных факторов питательной среды. Следовательно, генетическая вариабельность клеток каллуса может привести к получению растений с разным уровнем плоидности, что способствует расширению спектра сомаклональной изменчивости и созданию ценного исходного материала для целей селекции малины. Однако для этого необходимо разработать эффективную систему регенерации растений в каллусной культуре.

6.3. Морфогенез в культуре каллусной ткани. Базовой средой в экспериментах служила агаризованная питательная среда по прописи Андерсона, в некоторых вариантах – среда Мурасиге-Скуга. Наиболее эффективной для индукции морфогенеза в каллусной ткани является среда Андерсона с содержанием различных регуляторов роста в разных концентрациях и сочетаниях, но с преобладанием препаратов цитокининовой природой над ауксиновой. В результате проведенных экспериментов отобраны варианты сред, на которых наблюдалось формирование адвентивных побегов с частотой от 3,3 до 32,3% и этот процесс зависит от исходного генотипа и присутствующих в среде регуляторов роста. Варианты сред, которые обеспечивали наиболее высокий уровень стеблевого организма, представлены в таблице 10.

Для всех изученных генотипов отмечен положительный синергический эффект при совместном добавлении в регенерационную среду 5,0 мг/л или 10,0мг/л 6-БАП и 0,5мг/л ИУК (сорта Карнавал, Комета) или 0,5мг/л 2,4-Д (сорта Новость Кузьмина, Молинг промис). Относительно высокая (15,0мг/л) и низкая концентрация (1,0мг/л) 6-БАП, также его сочетание с ИУК или 2,4-Д не оказывала достаточного стимулирования эффекта регенерации. Присутствие ИМК было малоэффективно. Проявление морфогенетической активности 6-БАП (5,0 и 10,0 мг/л) зависело от взаимодействия с ИУК и 2,4-Д, при котором увеличивалась способность к дифференциации стеблевых почек в культуре недифференцированных клеток каллуса. Экспериментальные данные показали, что изменение основных параметров освещения при культивировании каллуса влияет на частоту стеблевого органогенеза, особенно у сортов с низким морфогенетическим потенциалом (Новость Кузьмина, Молинг промис), у которых этот показатель в варианте с предварительным культивированием в темноте (6 недель) при t=250С повысился примерно в 2 раза (табл. 11). Для всех изученных генотипов отмечен положительный синергический эффект при совместном добавлении в регенерационную среду 5,0 мг/л или 10,0мг/л 6-БАП и 0,5мг/л ИУК (сорта Карнавал, Комета) или 0,5мг/л 2,4-Д (сорта Новость Кузьмина, Молинг промис). Относительно высокая (15,0мг/л) и низкая концентрация (1,0мг/л) 6-БАП, также его сочетание с ИУК или 2,4-Д не оказывала достаточного стимулирования эффекта регенерации. Присутствие ИМК было малоэффективно. Проявление морфогенетической активности 6-БАП (5,0 и 10,0 мг/л) зависело от взаимодействия с ИУК и 2,4-Д, при котором увеличивалась способность к дифференциации стеблевых почек в культуре недифференцированных клеток каллуса.

Таблица 10 - Регенерация адвентивных побегов в культуре

каллусной ткани (возраст каллуса 100 суток)

Сорт	Вариант опыта с добавками регуляторов роста, мг/л	% регенерации	Количество побегов на каллусе, шт.
Карнавал	6-БАП 5,0 + ИУК 0,5	30,4	1,7
6-БАП 10,0 + ИУК 0,5	32,3	2,7
6-БАП 15,0 + ИУК 0,5	13,3	1,3
6-БАП 5,0 + 2,4-Д 0,5	18,8	1,5
6-БАП 10,0 + 2,4-Д 0,5	23,3	1,9
Комета	6-БАП 5,0 + ИУК 0,5	20,8	2,0
6-БАП 10,0 + ИУК 0,5	22,5	1,4
6-БАП 5,0 + 2,4-Д 0,5	13,8	1,3
6-БАП 10,0 + 2,4-Д 0,5	16,7	1,4
Новость Кузьмина	6-БАП 5,0 + ИУК 0,5	15,4	1,5
6-БАП 10,0 + ИУК 0,5	15,6	1,6
6-БАП 5,0 + 2,4-Д 0,5	18,2	1,7
6-БАП 10,0 + 2,4-Д 0,5	20,0	1,5
Молинг промис	6-БАП 5,0 + 2,4-Д 0,5	10,0	1,3
6-БАП 10,0 + 2,4-Д 0,5	13,3	2,0

Примечание: В таблице указаны варианты с частотой регенерации выше 10%.

Экспериментальные данные показали, что изменение основных параметров освещения при культивировании каллуса влияет на частоту стеблевого органогенеза, особенно у сортов с низким морфогенетическим потенциалом (Новость Кузьмина, Молинг промис), у которых этот показатель в варианте с предварительным культивированием в темноте (6 недель) при t=250С повысился примерно в 2 раза (табл. 11).

Следовательно, повышение частоты регенерации вызвано действием внешнего «раздражителя» (темноты) на клетки, что способствует активации окислительно-восстановительных реакций и метаболических процессов и как следствие заложению адвентивных почек.

Таблица 11 - Реакция каллуса на способность к регенерации при

предварительном культивировании в темноте и различной температуре

(среда Андерсона с 10,0 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ИУК)

Сорт	t=250С, 16-ч фотопериод (контроль)	t=250С, темнота 6 недель	t=40С, темнота 6 недель	НСР05
% регенерации	поб./ экспл., шт.	% регенерации	поб./ экспл., шт.	% регенерации	поб./ экспл., шт.
Карнавал	31,6	2,5	47,4	3,1	28,9	1,8	1,02
Комета	23,1	1,6	39,5	2,5	21,1	1,1	0,87
Новость Кузьмина	14,5	1,3	28,2	2,0	15,0	1,2	1,38
Молинг промис	7,5	1,3	17,5	1,6	5,0	1,0	1,21

На повышение регенерации влияет осмотическое давление питательных сред (каллусогенеза и морфогенеза). Повышение давления среды осуществлялось увеличением концентрации глюкозы с 30мг/л (стандарт среды Андерсона) до 60 и 90г/л. Регенерация побегов, в опыте повысилась, особенно этот показатель увеличивался (более чем в 2 раза) на среде с 90г/л глюкозы. Частота регенерации составила 39,1-62,5%, а в контроле – 18,8-25% (рис.4).

Рис. 4. Влияние осмотического давления среды на каллусогенез (питательная среда Андерсона 2,4-Д 4,0 мг/л) и регенерацию адвентивных побегов (питательная среда Андерсона, 6-БАП 10,0 мг/л и ИУК 0,5 мг/л)

Индуцированные в опытах побеги отделяли от каллуса и после тиражирования и получения идентичных копий укореняли на среде Андерсона с добавлением 1,0мг/л 6-БАП (этап размножения) и 0,5 мг/л ИМК (этап ризогенеза). Таким образом, оптимальный подбор гормонального состава, предварительное культивирование в темноте, повышение осмотического давления питательной среды позволяет повысить уровень стеблевого органогенеза в каллусной культуре. Сочетание указанных факторов обеспечивает стабильный выход растений-регенерантов и тем самым повышает эффективность биотехнологических методов в селекционном процессе.

6.4. Регенерация растений непосредственно из исходных эксплантов. Выявлены варианты регенерационных сред, которые вызывали на эксплантах развитие адвентивных побегов. Среди них выделены два варианта с содержанием регуляторов роста, обеспечивших наиболее высокую частоту стеблевого органогенеза: 1) 6-БАП (10,0мг/л)+ИУК (0,5мг/л); 2) 6-БАП (10,0мг/л)+2,4-Д (0,5мг/л). На этих средах регенерировали побеги как из дисков, так и из черешков. Установлена зависимость, заключающаяся в различной реакции и специфических требованиях эксплантов опытных генотипов на введение в состав среды морфогенеза регуляторов роста ауксиновой природы. При культивировании листовых эксплантов сортов Карнавал и Комета развитие побегов лучше происходило под влиянием ИУК, а у сортов Новость Кузьмина, Молинг промис и Кумберленд – 2,4-Д (табл. 12).

Таблица 12 - Стеблевой органогенез в культуре листовых дисков и черешков в зависимости от гормонального состава среды и генетических особенностей (1995г.)

Сорт	Тип экспланта	6-БАП (10,0 мг/л) + ИУК (0,5 мг/л)	6-БАП (10,0 мг/л) + 2,4-Д (0,5 мг/л)
экспланты с побегами, %	среднее число поб./эксп., шт.	экспланты с побегами, %	среднее число поб./эксп., шт.
Карнавал	л	45,7±7,0	2,1	39,1±6,9	1,9
ч	51,1±7,1	3,1	44,4±7,0	2,6
Комета	л	34,7±6,7	2,4	33,3±6,7	1,7
ч	44,2±7,0	2,8	36,4±6,8	2,0
Новость Кузьмина	л	23,5±5,9	1,5	32,4±6,6	2,3
ч	27,3±6,3	1,9	38,2±6,9	2,5
Молинг промис	л	15,6±5,1	1,0	21,2±5,8	1,6
ч	18,2±5,5	1,3	23,5±6,0	2,0
Кумберленд	л	17,6±5,4	1,2	28,6±6,4	1,9
ч	24,2±6,1	1,5	38,2±6,9	2,0

Примечание. л - листовые диски; ч – сегменты черешков листьев.