На правах рукописи
МОРОЗОВА НАТАЛЬЯ СТЕПАНОВНА
ВЛИЯНИЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЙ ТЕРАПИИ
НА ФАКТОРЫ АПОПТОЗА
ПРИ ГЛАУКОМАТОЗНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ
НЕЙРОПАТИИ
14.01.07 – глазные болезни
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2013
Работа выполнена на кафедре глазных болезней Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки РФ.
Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор
доктор биологических наук,
профессор
Официальные оппоненты:
, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. » Министерства здравоохранения РФ, заведующий кафедрой офтальмологии имени академика лечебного факультета
, доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт глазных болезней» Российской академии медицинских наук, старший научный сотрудник отдела глаукомы
Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика » Министерства здравоохранения РФ.
Защита состоится «____»________________2013 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 001.040.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт глазных болезней» Российской академии медицинских наук Москва, ул. Россолимо, д. 11, корп. Б.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИГБ» РАМН.
Автореферат разослан «_____» _________________ 2013 г.
Учёный секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Глаукоматозная оптическая нейропатия (ГОН) –прогрессирующее заболевание, морфологически характеризующееся гибелью ганглиозных клеток сетчатки и приводящее к постепенной потере зрительных функций [Bautista R. D., 1999]. Патогенез ГОН заключается в дегенеративном процессе, поражающем нервную ткань, как в подкорковых центрах, так и в аксонах, а затем и в телах ганглиозных клеток, и связан с нарушением аксонального транспорта. Потеря трофической поддержки и выход цитокинов остаётся общей причиной в патогенезе повреждения нервной клетки и возможной её гибели через апоптоз [, 2000]. Проблема разработки стратегии и выбора препарата фармакотерапии ГОН является одной из наиболее актуальных и, вместе с тем, самых сложных задач современной офтальмофармакологии [, 2002, , 2005]. Оптимальным является воздействие на патогенетические механизмы, приводящие к поражению зрительного нерва и развитию специфической оптической нейропатии [Фламмер Дж., Моцаффари M., 2007].
В этом аспекте интерес представляет цитиколин (Ceraxon®, «Nycomed», Австрия), который активизирует биосинтез структурных фосфолипидов мембран нейронов, увеличивает синтез фосфадилхолина и улучшает мозговой метаболизм. По данным зарубежных исследователей на модели глаукомы у животных цитиколин уменьшал апоптоз и увеличивал регенерацию нейронов [Oshitari T., Fujimoto N., Adachi-Usami E., 2002]. Основанием для выбора цитиколина в качестве нейропротектора явились данные о том, что указанный препарат способствовал подавлению экспрессии белков, участвующих в развитии апоптоза после ишемии [Parisi V., 1999, Pecori G. J., 2011]. Цитиколин снижает синаптическую концентрацию глутамата, свободных жирных кислот и свободных радикалов, а также повышает выживаемость нейронов в условиях гипоксии [Rao A. M., 1999, Mir C., 2003]. Эффекты цитиколина, выявленные в экспериментальных исследованиях, непосредственно связаны с воздействием на отдельные этапы апоптоза, в процессе которого участвует целый комплекс факторов, обладающих как апоптогенным потенциалом, так и их антагонистов. Запуск апоптоза опосредуется специфическими взаимодействиями по типу рецептор – лиганд [, 2011; Farkas R. H., 2001; Garcia-Valenzuela E., 1995]. Одним из мембранных клеточных рецепторов, ответственных за контролируемый тканевой гомеостаз и иммунный ответ, является белок Fas/Apo-1 (Fas-рецептор); ключевым индуктором гибели клетки – его лиганд (FasL). Нарушение физиологического равновесия между ними обусловливает участие данной системы (Fas/FasL), обладающей мощным апоптогенным потенциалом, в развитии многих патологических состояний. Важным антиапоптогенным фактором является мембраносвязанный белок Bcl-2, который выполняет функцию негативного регулятора апоптоза. Установлено, что уменьшение концентрации Bcl-2 приводит к апоптотической гибели клеток, тогда как сверхэкспрессия его защищает их от смерти [Park J. R., 1996; Quigley H. A., 1998; Cottet S., 2008]. В отечественной литературе отсутствуют работы по данному аспекту проблемы.
Разработка данного направления имеет не только научное, но и практическое значение для прогнозирования прогрессирования ГОН и патогенетически обоснованного назначения нейропротекции [Ling Z. H., 2012; Takahashi A., 2003]. Доказательная база эффективности цитиколина при лечении ГОН, основанная на комплексных клинико-лабораторных исследованиях, на сегодняшний день отсутствует.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучение влияния нейропротектора цитиколин на факторы апоптоза и клинико-функциональные показатели при глаукоматозной оптической нейропатии.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Оценить клиническую эффективность нейропротектора цитиколин в лечении больных с ГОН с нормализованным (до среднестатистического нормального диапазона значений) внутриглазным давлением и нестабильными зрительными функциями;
2. Изучить роль факторов Fas-апоптоза (sApo-1/Fas, sFasL) и антиапоптозного белка Bcl-2 в патогенезе ПОУГ по результатам исследования количественного содержания их растворимых форм в слёзной жидкости и сыворотке крови;
3. Изучить влияние минимальной терапевтической дозы цитиколина (500 мг/сутки) на содержание sApo-1/Fas, sFasL и Bcl-2 в слёзной жидкости и сыворотке крови у больных ПОУГ;
4. Разработать клинико-иммунологические критерии прогнозирования течения глаукоматозного процесса на основе определения содержания маркёров апоптоза до и после применения цитиколина у больных с разными стадиями ПОУГ;
5. Оценить связь между улучшением клинико-функциональных показателей (периметрии и ретинотомографии) и изменением маркёров апоптоза (на местном и системном уровнях) в условиях применения цитиколина.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
1. Впервые у больных с разными стадиями ПОУГ предпринято исследование sFasL и sApo-1/Fas (индуктора апоптоза и его рецептора) и Bcl-2 в слёзной жидкости и сыворотке крови. В результате динамических наблюдений до и на фоне лечения цитиколином установлена взаимосвязь между периметрическими показателями (светочувствительность, средний дефект) и локальными маркёрами апоптоза, что указывает на участие последних в патогенезе ГОН.
2. Разработан способ прогнозирования прогрессирования ПОУГ путём определения уровней белка Bcl-2 в слёзной жидкости и/или сыворотке крови (приоритетная справка по заявке на патент РФ № от 22.11.12). Выявлены взаимосвязи между клинико-функциональными показателями и содержанием маркёров апоптоза при ПОУГ (sFas/APO-1, sFasL и Bcl-2), что указывает на их участие в процессах гибели (атрофии) волокон зрительного нерва у больных с ГОН.
3. Впервые установлены иммунокорригирующие свойства цитиколина и их роль в механизме терапевтического действия препарата при ПОУГ. Показано, что эффективность лечения цитиколином зависит от стадии глаукомы, исходных показателей апоптоза и их изменениях после лечения. Установлено, что улучшение клинико-функциональных показателей на фоне терапии с применением цитиколина сопровождается изменениями маркёров апоптоза (повышение уровней sFas/APO-1 и антиапоптозного белка Bcl-2, снижение индуктора апоптоза sFasL в слёзной жидкости), что может иметь позитивное прогностическое значение.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Результаты проведённых клинико-иммунологических исследований позволют расширить представления об общих и местных патоиммунологических процессах, протекающих при глаукоматозной оптиконейропатии, предложить иммунологические тесты прогнозирования и динамического контроля заболевания, в частности препаратами, ограничивающими активность индукторов и регуляторов апоптоза: sApo-1/Fas, sFasL и Bcl-2. Предложенное в этом аспекте использование цитиколина для лечения и профилактики прогрессирования глаукоматозной оптиконейропатии является патогенетически направленным и обоснованным.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Применение при ПОУГ нейропротектора цитиколин приводит к стабилизации зрительных функций, улучшению периметрических индексов (MD-средний дефект, MS-светочувствительность).
2. Растворимые формы Bcl-2, Apo-1/Fas и FasL, обнаруживаемые в слёзной жидкости и сыворотке крови человека, могут служить индикаторами развития апоптотического процесса на местном и системном уровнях. Подтверждённые статистически изменения маркёров апоптоза (особенно явные при исследовании слёзной жидкости) в зависимости от стадии ПОУГ и выраженности клинико-функциональных признаков ГОН свидетельствуют об участии исследованных факторов в патогенезе заболевания.
3. Эффективность применения цитиколина для лечения и профилактики прогрессирования ГОН зависит от стадии заболевания, исходных показателей апоптоза и их динамики на фоне терапии.
4. Разработаны иммунологические критерии неблагоприятного течения глаукоматозного процесса на основании тестирования факторов апоптоза в слёзной жидкости и сыворотке крови. Наиболее информативными индикаторами апоптотического процесса, связанного с прогрессированием ГОН, является отсутствие Bcl-2 в обеих тест-пробах и снижение sFas/Apo-1 в слёзной жидкости при наблюдении больных в динамике.
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ В ПРАКТИКУ
Результаты практических разработок внедрены в клиническую практику офтальмологического отделения ГКБ №12. Материалы исследований включены в программу лекций и практических занятий кафедры офтальмологии РУДН.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: III-V Российских общенациональных офтальмологических форумах (Москва, ); VIII-IХ Международных конференциях «Глаукома: теории, тенденции, технологии. HRT Клуб Россия» (Москва, 2010, 2011); Научно-практической конференции офтальмологов Северо-Запада «Глаукома: теория и практика» (Спб, 2011); X-XI Всероссийских школах офтальмолога (Снегири, 2011, 2012); III Международной научной конференции «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2011); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011); Международных научно-практических конференциях «Восток-Запад» (Уфа, 2011, 2012); IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фёдоровские чтения-2011»; на заседании кафедры глазных болезней медицинского факультета РУДН (Москва, 2013).
ПУБЛИКАЦИИ
По материалам диссертации опубликовано 26 работ, из них 8 – в изданиях, рекомендуемых ВАК, в которых содержится полный объём информации, касающейся темы диссертации; подана заявка на патент.
СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация изложена на 149 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 37 рисунками. Список литературы содержит 315 источников, из них 96 отечественных и 219 – зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы клинико-офтальмологические и лабораторные (иммунологические) методы исследования.
Клинико-офтальмологические исследования проведены на кафедре глазных болезней РУДН (зав. каф. – д. м.н., проф. ) у 129 больных (228 глаз) с I-III/IV стадиями ПОУГ и нормализованным (до среднестатистического нормального диапазона значений) внутриглазным давлением в возрасте от 59 до 75 лет (средний возраст 67±8,4 года). Клиническое обследование проводили непосредственно до лечения и на следующий день после завершения курса терапии. Дальнейшее наблюдение осуществляли через 1, 3, 6 и 12 месяцев. Медиана времени наблюдения за больными составила 32,5 месяца (от 6 до 36 месяцев).
Офтальмологические методы исследования включали: визо - и рефрактометрию, тонометрию по Маклакову, биомикроскопию, офтальмоскопию, статическую компьютерную периметрию на «Octopus» 101 (Interzeag AG, Швейцария), с помощью которой оценивали динамику изменений поля зрения по показателям: средней светочувствительности сетчатки (индекс MS, mean sensitivity), среднему дефекту (индекс MD, mean defect). RF (reliability factor) – степень достоверности исследования, во всех случаях был менее 15%. На приборе «Периком» оценивали количество относительных (I и II порядка) и абсолютных скотом. Ретинальную томографию (прибор Heidelberg Retina Tomograph III фирмы Heidelberg Engenering – HRT-III) с оценкой слоя нервных волокон сетчатки (параметр RNFL, мм).
Критериями включения больных в исследование являлись: диагностированная ПОУГ I-III стадий, устойчивая компенсация офтальмотонуса, достигнутая медикаментозно и/или хирургически, и отсутствие стабилизации зрительных функций в течение последних 6 месяцев. Исключались больные с патологией макулярной области, зрелой катарактой, терминальной глаукомой.
На основании офтальмологического обследования больные были рандомизированы случайным образом на три сопоставимые группы: основные (IА, IБ) и сравнения (II) по 43 человека в каждой, с учётом возраста, гендерного фактора и стадии ПОУГ (табл.1).
Таблица 1
Характеристика терапевтических групп
Характеристики | Основные группы | Группа сравнения | |||||
I A (n=43) | I Б (n=43) | II (n=43) | |||||
абс. | % | абс. | % | абс. | % | ||
Количество пациентов (глаз) | 43 (78) | 100 | 43 (74) | 100 | 43 (76) | 100 | |
Средний возраст (M±m) | 67,4 ± 0,99 | 69,9 ± 0,99 | 68,8 ± 0,66 | ||||
Мужчины | 19 | 44,2 | 21 | 48,8 | 22 | 51,2 | |
Женщины | 24 | 55,8 | 22 | 51,2 | 21 | 48,8 | |
Стадия глаукомы | Начальная | 18 | 41,9 | 12 | 33,3 | 17 | 37 |
Развитая | 20 | 46,5 | 22 | 60 | 22 | 54,3 | |
Далекозашедшая | 5 | 11,6 | 9 | 6,7 | 4 | 8,7 | |
Схемы лечения: больные основных групп в течение 10 дней получали внутривенные инъекции цитиколина в дозах 1000 мг/сутки (группа IА) и 500 мг/сутки (группа IБ); в группе сравнения (группа II) применялась традиционная терапия (Эмоксипин 1,0% - 1,0 мл, Ксантинола никотинат 15% - 2,0 мл, вит В6 5% - 2,0 мл, вит В12 5% - 2,0 мл внутримышечно, «Аевит» по 1 капсуле 2 раза в день). Курс лечения составил 10 дней.
Иммунологические исследования проводились в лаборатории иммунологии и вирусологии (рук.– д. б.н., проф. ) ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца МЗ России» (директор – засл. деятель науки РФ, д. м.н., проф. ). С помощью ИФА в слёзной жидкости и сыворотке крови определяли растворимые формы факторов Fas-апоптоза (sApo-1/Fas и sFasL) и Вcl-2. Использовали тест-системы «Bender MedSystems», Австрия. Забор тест-проб производился до и после лечения цитиколином (по схеме 500 мг/сутки в течение 10 дней).
Всего исследовано 54 пробы сыворотки крови (28 до и 26 после курса цитиколина) и 100 проб слёзной жидкости (56 и 44, соответственно) от 28 пациентов (56 глаз) с разными стадиями ПОУГ. Групповое распределение проб сыворотки крови проводилось с ориентацией на худший глаз. В качестве контроля были исследованы пробы сыворотки крови (10) и слёзной жидкости (20), полученные у 10 добровольцев сопоставимого возраста (от 50 до 64 лет) и пола, не имевших признаков офтальмопатологии и/или сопутствующих заболеваний.
Статистическая обработка материала выполнена с помощью программы «BIOSTATD» (t-критерий Стьюдента, критерий Фишера и χ2).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты клинико-функциональных исследований. В группе больных, получавших традиционную терапию количество относительных скотом I и II порядка, а также абсолютных скотом, достоверно (p<0,05) сократилось на всех стадиях ПОУГ сразу после завершения курса терапии и сохранялось в течение 3 месяцев. Тенденция к ухудшению полученного результата и возвращение к исходным параметрам отмечалась к году после проведённого лечения у больных на начальной и развитой стадиях ПОУГ. Разница по параметрам относительных скотом I порядка составила: 2,9%-3,0%: II порядка – 0,9%-0,4%; абсолютных скотом – 0,1%-0,4%, соответственно. На далекозашедшей стадии к 12 месяцам все параметры возвращались к исходным данным и в ряде случаев были хуже исходных показателей.
В основной 1Б группе (цитиколин 500 мг/сутки) количество относительных скотом I и II порядка, а также абсолютных скотом, имело выраженное и стойкое улучшение через 3 месяца после курса терапии у больных на I и II стадиях ПОУГ, оставаясь стабильной в сроки до 12 месяцев Уменьшение относительных скотом (I и II порядка) и абсолютных скотом, по стадиям в сравнении с данными до лечения составило 10,7%-4,9%; 5,4%-2,7% и 0,7%-1,5%. На III стадии ПОУГ эффект от проведённой терапии был менее значимым, сохранялся только 3 месяца и быстро возвращался к исходным данным.
В основной группе IA (цитиколин 1000 мг/сутки) количество относительных скотом I и II порядка, а также абсолютных скотом значительно уменьшилось в течение 3-х месяцев после лечения, независимо от стадии ПОУГ. В отдалённые сроки (12 месяцев) улучшение сохранялось у больных на I и II стадиях. Разница с исходными данными по снижению количества относительных (I и II порядка) и абсолютных скотом составила 11,2%-2,1%; 4,8%-2,7%; 0,6%-0,4% соответственно. Сокращение абсолютных скотом было незначительным. На далекозашедшей стадии ПОУГ эффект от проведённой терапии был менее значимым в срок 3 месяцев после лечения и, как и при минимальной дозе цитиколина (500 мг/сутки), быстро возвращался к исходным значениям к 6-му месяцу. Динамика индекса MD (mean defect), MS (mean sensitivity) у больных с разными стадиями ПОУГ в зависимости от вида лечения представлена на рис.1-2.
Таким образом, на фоне предложенной нейропротекторной терапии – парентерального введения цитиколина в дозах 1000 и 500 мг/сутки отмечено статистически достоверное (p<0,05) улучшение исследуемых показателей по сравнению с группой сравнения, получавшей традиционную терапию.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
p – достоверность различий относительно показателей до лечения
Рис.1. Динамика показателя периметрии MD (mean defect) у больных с разными стадиями ПОУГ в зависимости от вида лечения.
1 - до лечения 2 - через 3 месяца 3 - через 6 месяцев
|
|
|
|
|
|
|
|
|
p – достоверность различий относительно показателей до лечения
Рис.2. Динамика показателя периметрии MS (mean sensitivity) у больных с разными стадиями ПОУГ в зависимости от вида лечения.
При применении максимальной дозы цитиколина (1000 мг/сутки) динамика клинико-функциональных параметров оказалась наилучшей. Уменьшение количества абсолютных и относительных скотом I и II порядка с качественным переходом на другой (лучший) уровень, было наиболее явным максимально к 3 месяцу и сохранялось в течение 12 месяцев у больных на I и II стадиях ПОУГ. У пациентов на III стадии отмечалась достоверная, но менее выраженная динамика этих параметров, которая возвращалась к исходным значениям к концу 6 месяца после проведённого лечения. Динамика индексов MS (mean sensitivity), MD (mean defect) подтверждает полученные изменения. Подобная тенденция отмечена и при использовании минимальной дозы цитиколина (500 мг/сутки), когда улучшение исследуемых показателей у больных на I и II стадиях ПОУГ также было выражено максимально к 3 месяцу и стабильно сохранялось в течение 12 месяцев. На III стадии уменьшение количества абсолютных и относительных скотом (I и II порядка) наблюдалось в течение 3 месяцев, было выражено слабее, возвращение к исходным значениям – в основном также к 6-му месяцу. Полученные данные свидетельствуют об актуальности нейропротекторной терапии на всех стадиях ПОУГ. Критический период для оценки динамики процесса и результатов лечения (6 месяцев) вызывает необходимость переосмысления периодичности консервативного лечения. Результат лечения определяется индивидуальной ситуацией, поскольку ответ на подобную терапию неодинаков, зависит от стадии ПОУГ и, в меньшей степени, от дозы препарата, сроков оценки результатов, а также от ряда других патогенетических факторов. Среди последних особое внимание привлекают факторы апоптоза, исследование которых и явилось предметом иммунологического раздела нашей работы.
Результаты иммунологических исследований. Иммунологические исследования показали, что содержание факторов апоптоза в слёзной жидкости и, в значительно меньшей степени, в сыворотке крови может служить индикатором как апоптотического, так и связанного с ним глаукоматозного процесса (табл.2).
Таблица 2
Маркёры апоптоза у больных с разными стадиями ПОУГ
Стадия ПОУГ | Число проб СЖ/СК* | sApo-1/Fas (пг/мл) | sFasL (пг/мл) | Bcl-2 (Ед/мл) | |||
СЖ | СК | СЖ | СК | СЖ | СК | ||
контроль | 20/10 | 497± 157 | 212± 45 | 75±5 | <10 | 0,1±0,02 | 7,0±2,11 |
Подозрение на глаукому | 6/2 | 1062±5761 | 74±5 | 60±10 | <103 | 4,9±2,15 | 6,9±1,38 |
I | 8/4 | 1081±2871 | 178±9 | 40±4 | 32±22 | 2,0±1,1 | 4,9±4,69 |
II | 18/6 | 702±3502 | 211±78 | 74±17 | 75±153,4 | 7,3±1,86 | 5,9±0,910 |
III | 18/10 | 486±156 | 154±33 | 61±15 | 35±16 | 3,5±1,57 | отр. |
IV | 6/6 | 161±921,2 | 201±39 | 40±6 | 14±44 | отр | отр. |
Примечания: достоверные отличия: для sApo-1/Fas: 1(подозрение на глаукому+I ст.) – IV ст. (р=0,046); 2 II ст. – IV ст. (р=0,000); для sFasL: 3 подозрение на глаукому – II ст. (р=0,036); 4 II ст.–IV ст. (р=0,047); для Bcl-2: по отношению к IV ст.: 5(р=0,004);6(р=0,003);7(р=0,002); 8(р=0,000); 9(р=0,026); 10(р=0,000) |
Установлено, что начальные стадии ПОУГ характеризовались активизацией системы Fas/FasL, играющей ключевую роль в запуске апоптоза. При этом проявлялось «противоборство» индукторного (sFasL) и рецепторного (sApo-1/Fas) факторов, что было наиболее заметно на местном уровне (рис.3).
Прогрессирование заболевания и переход в терминальную стадию ассоциировались с явным уменьшением содержания обоих факторов в слёзной жидкости и тенденцией к возвратному восстановлению – в сыворотке крови. Надо полагать, что это отражало «истощение» Fas-опосредованного звена апоптоза и переход в следующую фазу апоптотического процесса, связанную с другими его маркёрами.
|
|
Рис.3. Соотношение sApo-1/Fas и sFasL (пг/мл) в слёзной жидкости у больных ПОУГ в динамике глаукоматозного процесса.
Исследование антиапоптозного белка Bcl-2 показало, что уже на I-ой стадии ПОУГ проявлялась тенденция к уменьшению его содержания в сыворотке крови и в слёзной жидкости (по сравнению с контролем и/или подозрением на глаукому). После локального, по-видимому – защитного, всплеска уровня Bcl-2 на II-ой стадии, отмечалось падение его в обеих тест-пробах. Переход в терминальную стадию ассоциировался с явным сочетанным (местным и системным) дефицитом этого фактора.
Существенные различия, выявленные при исследовании факторов Fas - апоптоза и Bcl-2 у больных с разными стадиями ПОУГ, были расценены нами как свидетельство их участия в патогенезе глаукоматозного процесса.
Это подтвердили и данные, полученные при сопоставлении маркёров апоптоза (особенно – локальных) с клинико-функциональными признаками ГОН. Установлено, что показатели увеличения дефекта, ослабления светочувствительности сетчатки (высокий индекс MD, низкий индекс MS) и уменьшения толщины слоя нервных волокон сетчатки (низкий RNFL) ассоциировались с минимальными уровнями sApo-1/Fas (<100 пг/мл) и максимальными sFasL (>100 пг/мл) в слёзной жидкости. Особенно неблагоприятным оказалось отсутствие в слезе, а также в сыворотке крови, антиапоптозного белка Bcl-2 (табл.3).
Таблица 3
Показатели периметрии (индексы MS и MD) и ретинотомографии (RNFL) при различных уровнях Bcl-2 в слёзной жидкости у больных ПОУГ
Bcl-2 (Ед/мл) | Число проб | Светочувствительность, MS, (дБ), М±m | Средний дефект, MD, (дБ), М±m |
Слой нервных волокон сетчатки, RNFL, (мм), М±m | |
Интервалы уровней | Средний уровень М±m | ||||
отриц. | < 0,50 | 8 | 17,28±0,97 | 7,47±0,22 | 0,149±0,010 |
0,50 – 1,50 | 0,97±0,12 | 10 | 23,30±0,74 p=0,000 | 4,48±0,38 p=0,000 | 0,199±0,006 p=0,000 |
2,0 - 6,50 | 4,37±0,37 | 12 | 21,65±0,52 p=0,000 | 5,87±0,57 p=0,042 | 0,170±0,007 p=0,045 |
7,0 - 10,0 | 8,05±0,39 | 8 | 20,25±1,19 | 7,45±0,4 | 0,166±0,008 |
12,0 - 18,0 | 14,23±1,23 | 6 | 20,70±0,38 p=0,013 | 6,86±0,97 | 0,174±0,010 p=0,014 |
Примечание: p – достоверность различий по сравнению с клинико-функциональными показателями у больных с отсутствием Bcl-2
Обобщение результатов клинико-иммунологических исследований позволило нам разработать критерии прогнозирования течения глаукоматозного процесса с учётом стадии заболевания на момент обследования (табл.4). Наиболее информативными показателями, связанными с прогрессированием ГОН, по нашим данным, являются отсутствие Bcl-2 в обеих тест-пробах и падение уровня sApo-1/Fas в слёзной жидкости в динамике.
Изучение возможностей медикаментозного воздействия на изучавшиеся факторы апоптоза показало, что применение цитиколина (500 мг/сутки) у большинства больных приводило к значительному (в 1,5 раза и более) подъёму уровней антиапоптозного белка Bcl-2 в сыворотке крови (76,9%) и, что особенно важно, в слёзной жидкости (81,8%). Кроме того, почти в половине случаев (45,6%) наблюдалось прогностически благоприятное увеличение содержания в слёзной жидкости sApo-1/Fas и параллельное падение sFasL (очевидно, вследствие взаимодействия между этими факторами).
Таблица 4
Критерии прогнозирования течения ПОУГ на основе определения маркёров апоптоза в слёзной жидкости и сыворотке крови
Стадия развития ПОУГ | Маркёры апоптоза | |||||
sApo-1/Fas | sFasL# | Bcl-2 | ||||
СЖ | СК | СЖ | СК | СЖ | СК | |
Риск возникновения |
| * | * | * |
| * |
Показатель прогрессирования (на I – II-ой стадиях) |
| * |
|
|
|
|
Риск перехода в терминальную стадию |
| * |
|
|
|
|
**
**
**
**
**
**
**
Примечание: #дополнительная информация при условии исследования Bcl-2 и sApo-1/Fas; * не информативно; ** информативно только в динамике;
Обнаружено, что воздействие цитиколина зависело от фоновых значений маркёров апоптоза. При максимальных исходных уровнях Bcl-2 и sApo-1/Fas отмечались случаи снижения их содержания после применения препарата (рис. 4).
|
|
|
|
|
p – достоверность различий при сравнении уровней sApo-1/Fas перед началом и после окончания курса лечения цитиколином
Рис.4. Изменение на фоне лечения цитиколином уровня sApo-1/Fas (пг/мл) в слёзной жидкости при разных исходных уровнях.
В целом это указывало на определенный иммунокорригирующий эффект цитиколина и важность учёта фоновых иммунологических показателей при назначении лечения.
Влияние лечения цитиколином на клинико–функциональные параметры ПОУГ в зависимости от фоновых показателей апоптоза. Установлено, что прогностически благоприятные сдвиги маркёров апоптоза на фоне терапии цитиколином коррелируют с положительной динамикой периметрических индексов, подтверждая вклад иммунокоррекции и нейропротекции в механизм терапевтического действия препатата.
Наиболее явно это проявилось при сопоставлении количественного содержания локальных маркёров апоптоза с показателями периметрии (снижение дефекта и повышение светочувствительности). Так, наиболее достоверное снижение дефекта в поле зрения (индекс МD) на фоне лечения цитиколином коррелировало с отмеченным выше увеличением в слёзной жидкости содержанием Bcl-2 и sApo-1/Fas (рис.5 и 6).
|
|
|
|
|
p – достоверность различий при сравнении показателей MD перед началом и после окончания курса лечения цитиколином
Рис.5. Изменение на фоне лечения цитиколином периметрического индекса MD при различных исходных уровнях Bcl-2 (Ед/мл) в слёзной жидкости у больных с ПОУГ.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Рис.6. Изменение на фоне лечения цитиколином периметрического индекса MD при различных исходных уровнях sApo-1/Fas (пг/мл) в слёзной жидкости у больных с ПОУГ.
Характерно, что терапевтический и иммунокорригирующий эффект препарата проявлялся как на начальной и развитой, так и на далекозашедшей стадиях ПОУГ, хотя и в меньшей степени (рис1-2.), что подтверждает мнение о перспективности его применения у больных с ГОН.
Вместе с тем, анализ и обобщение представленных данных позволяют заключить, что для усиления и закрепления полученных результатов целесообразно проводить повторные курсы лечения цитиколином с индивидуальным подбором доз препарата и учётом иммунологического фона, в частности маркёров апоптотического процесса.
ВЫВОДЫ
1. Впервые в клинических условиях на 129 больных с ГОН с нормализованным (до среднестатистического нормального диапазона значений) внутриглазным давлением и нестабильными зрительными функциями проведены комплексные (клинико-иммунологические) исследования, направленные на изучение роли апоптотического процесса и влияние нейропротектора цитиколин на факторы апоптоза и клинико-функциональные показатели.
2. У больных с ГОН цитиколин проявил свойства эффективного нейропротектора. Применение препарата в дозах 500 и 1000 мг/сутки в течение 10 дней способствует оптимизации лечения больных, по сравнению с традиционной терапией, что подтверждается улучшением клинико-функциональных показателей: уменьшением площади абсолютных и относительных скотом, повышением светочувствительности сетчатки (индекс MS), снижением среднего дефекта (индекс MD). Более выраженный и стойкий терапевтический эффект отмечен на начальной и развитой стадиях ПОУГ. Результаты лечения на далекозашедшей стадии оказались менее выражены и имели тенденцию к возвращению к исходным показателям.
3. Лучшие результаты по длительности стабилизации глаукоматозного процесса (12 мес. – срок наблюдения) отмечены при применении дозы цитиколина 1000 мг/сутки. При анализе данных периметрии у больных, получавших цитиколин в дозе 1000 мг/сутки в течение 10 дней, спустя 3 месяца отмечено повышение светочувствительности сетчатки (индекс MS) с 20,33±1,04 до 28,76±1,19 дБ (p<0,001), снижение дефекта (индекс MD) с 7,09±1,07 до 3,38±0,76 (p<0,001), что свидетельствует об эффекте последействия, который сохранялся до 6 месяцев после проведённой терапии. Меньшая доза препарата (500 мг/сутки) давала менее выраженный и стойкий (3-6 мес.) терапевтический эффект.
4. Свидетельством участия изученных факторов апоптоза в патогенезе ПОУГ являются статистически подтверждённая связь между уровнями растворимых форм sApo-1/Fas, sFasL и Bcl-2 в слёзной жидкости и, в меньшей степени, в сыворотке крови (по отдельным показателям: Bcl-2, sFasL) и стадиями развития заболевания, а также выраженностью клинико-функциональных признаков ГОН и их количественными изменениями на фоне лечения цитиколином.
5. Исследованные маркёры апоптоза являются индикаторами развития апоптотического и связанного с ним процесса прогрессирования ГОН. Высокие уровни sApo-1/Fas (1062±576 пг/мл; р=0,046) и Bcl-2 (14,2±1,2 Ед/мл; р=0,004) в слёзной жидкости могут служить предвестниками заболевания. Наиболее информативными показателями прогрессирования ГОН и перехода в терминальную стадию ПОУГ является снижение содержания sApo-1/Fas в слёзной жидкости (до 161±92 пг/мл; р=0,000) и полное исчезновение Bcl-2 как в слёзной жидкости (р=0,004), так и в сыворотке крови (р=0,000).
6. Парентеральное введение цитиколина больным ПОУГ (500 мг/сутки, в течение 10 дней) в большинстве случаев приводит к значительному изменению содержания в слёзной жидкости и сыворотке крови растворимых форм sApo-1/Fas (45,6% и 53,2% соответственно), sFasL (45,6% и 76,7%) и Bcl-2 (81,8% и 76,9%). Направленность сдвигов зависит от фоновых значений: подъём уровней Bcl-2 и sApo-1/Fas имеет место при исходно низких или умеренных уровнях, снижение – при исходно высоких; динамика сдвигов sFasL отличается противоположной направленностью. В целом это свидетельствует об иммунокорригирующих свойствах препарата.
7. Прогностически благоприятные сдвиги маркёров апоптоза (повышение уровней Bcl-2 и sApo-1/Fas в сыворотке крови и, особенно, в слёзной жидкости) на фоне терапии цитиколином находятся в корреляционной зависимости с улучшением клинико-функциональных показателей (по данным периметрии), подтверждая иммунокорригирующий и нейропротекторный эффект лечения.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Цитиколин может быть использован у больных с ГОН в терапевтических дозах: 500 мг/сутки на начальной, развитой и 1000 мг/сутки на далекозашедшей стадиях глаукомы в течение 10 дней парентерально. Оптимальной дозой для достижения более стойких результатов на всех стадиях ПОУГ является 1000 мг/сутки.
2. Рекомендуемая кратность курсов нейропротекции при применении цитиколина: на начальной и развитой стадиях каждые 6 месяцев, на далекозашедшей стадии – каждые 3 месяца.
3. С целью контроля терапии целесообразно исследование слёзной жидкости (и сыворотки крови – в качестве дополнительного теста) на определение факторов апоптоза (sApo-1/Fas, и особенно Bcl-2) до начала и в динамике лечения. Повышение исходно низких/умеренных уровней этих факторов в слёзной жидкости, а также Bcl-2 в сыворотке крови, подтверждает благоприятное воздействие лечения: уменьшение значений указывает на отсутствие иммунокорригирующего эффекта.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Опыт применения цитиколина в лечении глаукоматозной оптической нейропатии / , С., // III Рос. общенац. офт. форум: Сборник трудов научно–практ. Конф. с междунар. уч., 7-8 окт. 2010г.–М.: МНИИГБ им. Гельмгольца. 2010. Т.1.–С. 415-419.
2. Влияние цитиколина (CDP – choline) на зрительные функции и некоторые лабораторные показатели липидного спектра сыворотки крови у больных ПОУГ / , С. , // «Клиническая офтальмология» – Т.11.-№3.-2010.-С.82-83.
3. Клинические аспекты применения цитиколина в условиях консультативно-диагностического центра / , С. , , // Сб. научн. трудов регион. конф. «Глаукома: теория и практика» – СПб., 2011. С.113-116.
4. Нейропротекция при ПОУГ: Возможности применения цитиколина / , С., Ловпаче Дж. Н. // Матер. Х Всерос. шк. офтальм.– М. 2011.-С.121-124.
5. Роль ноотропного препарата с антиоксидантными свойствами в терапии первичной открытоугольной глаукомы / , , // Там же.– С. 124-127.
6. Лазерная сканирующая ретинотомография как метод мониторинга пациентов с глаукоматозной оптической нейропатией / , // Сборник тезисов III Международной научной конференции «Клинические и теоретические аспекты современной медицины». М. 2011.- С. 58.
7. Сравнительный анализ применения различных доз цитиколина в лечении больных с первичной открытоугольной глаукомой / , // Там же. М. 2011.- С.59.
8. Коррекция зрительных нарушений у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой препаратом цитиколин / , С. , // Вестник РУДН-№2.-2011. С. 103-106.
9. Клиническая эффективность цитиколина (CDP – choline) в лечении больных первичной открытоугольной глаукомой / , , // XVIII Рос. нац. конгресс «Человек и лекарство»: М.,-2011.-241 с.
10. Эффективность и безопасность пероральной формы цитиколина (CDP – choline) в лечении глаукоматозной оптической нейропатии / , , // Междунар. науч. – практич. конф. «Восток – Запад» // Сб. научн. трудов, посвящ. 85-лет. Уф. НИИ гл. бол. – Уфа. 2011.-С. 207-209.
11. Влияние терапии цитиколином на качество жизни больных с глаукоматозной оптиконейропатией / , , , // IX Всерос. научн. – практич. конф. с междунар. уч. «Фёдоровские чтения – 2011». 22-24 июня 2011г., М. ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. Росмедтехнологии»: Сб. тез.-2011. – С.312-313.
12. Информативность лазерной ретинотомографии в оценке эффективности нейропротекции при первичной открытоугольной глаукоме / С., , , // Там же. – С.332-333.
13. Эффективность консервативного лечения первичной открытоугольной глаукомы у больных с нормализованным офтальмотонусом / С. , , // Там же. С. 334-335.
14. Влияние парентерального применения цитиколина на зрительные функции и качество жизни больных с первичной открытоугольной глаукомой / , , , , // Вестн. Офтальмол.–2011.-Т.127.-№ 5.-С. 17-21.
15. Цитиколин: перспективы применения при первичной открытоугольной глаукоме / , , , // Рос. Офтальмол. Журнал // Том 4.-№4. -2011.-С.108-112.
16. Анализ клинической эффективности и безопасности препарата CERAXON® при первичной открытоугольной глаукоме / , С. , , А. // Вестник РУДН–№ 2.–2012.С.100-103.
17. Эффективность, безопасность и взаимодействие лекарственных препаратов при лечении больных с первичной открытоугольной глаукомой / , , , , , А. // IV Рос. общенац. офт. форум: Сб. трудов научн.-практ. конф. с междунар. уч., 5-7 окт. 2011г., М: МНИИГБ им. Гельмгольца. 2011. Т. 1.–С. 342-343.
18. Клиническая эффективность комплексной нейрометаболической и антиоксидантной терапии при первичной открытоугольной глаукоме / , С., , , А. и др. // Там же. – С. 343-350.
19. Клиническое использование препарата CERAXON® при первичной открытоугольной глаукоме / , С., // Глаукома: теории, тенденции, технологии. HRT Клуб России 2011: сб. тез. IX Междунар. конф. – М., 2011.-С. 337-341.
20. Анализ клинической эффективности комплексной терапии у пациентов с глаукоматозной оптиконейропатией / , С., , , // «Земский врач»–2012. №1(11). С. 24-27.
21. Маркёры Fas-опосредованного апоптоза при первичной открытоугольной глаукоме и возможности их фармакологической коррекции / , , С., Ловпаче Дж. Н. // Вестн. Офтальмол.–2012.–Т.128.–№ 4.–С. 27-31.
22. Митохондриальная патология и первичная открытоугольная глаукома / , , // Матер. ХI Всерос. школы офт.-М.2012.-С.114-117.
23. Факторы Fas-опосредованного апоптоза при первичной открытоугольной глаукоме / , , С., Ловпаче Дж. Н. // Междунар. научн.–практич. конф. «Восток-Запад» // Сб. научн. Тр.-Уфа.2012.–С.246-247.
24. Роль про - и антиапоптотических факторов в патогенезе глаукоматозной оптической нейропатии и изменение их секреции в условиях лечения цитиколином / , , Дж. Н. Ловпаче, , // V Рос. общенац. офт. форум: Сборник трудов научн.–практичю конф. с междунар. уч., 3-5 октября 2012г.–М: МНИИГБ им. Гельмгольца. 2012.Т. 1.-С.123-126.
25. Исследование антиапоптозного белка Bcl-2 в слёзной жидкости и сыворотке крови и его значение для понимания патогенеза и обоснования нейропротекции при первичной открытоугольной глаукоме / , , Ловпаче Дж. Н. // Рос. Офтальмол. журнал // Том 6.-№1.-2013.-С. 48-52.
26. Маркёры апоптоза у больных с глаукоматозной оптической нейропатией / , , Ловпаче Дж. Н. // Рос. Иммунологич. журнал // Том 7 (16). - №2С. 254.
ПАТЕНТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕ
«Способ прогнозирования прогрессирования первичной открытоугольной глаукомы путём определения белка Bcl-2 в слёзной жидкости и/или сыворотке крови» / , , , , Ловпаче Дж. Н. Заявка на патент РФ № от 22.11.12.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГОН–глаукоматозная оптическая нейропатия ИФА–иммуноферментный анализ СЖ–слёзная жидкость СК–сыворотка крови ПОУГ–первичная открытоугольная глаукома Bcl-2 (B-cell lymphoma 2)–В-клеточной лимфомы подобный протеин HRT III (Heidelberg Retina Tomograph III)–ретинальная томография | MD (mean defect)–средний дефект, отражающий диффузное снижение светочувствительности сетчатки MS (mean sensitivity)–средняя светочувствительность сетчатки RNFL (retinal nerve fiber layer)–слой нервных волокон сетчаткиSAP–статическая автоматическая периметрияsApo-1/Fas (soluble)–растворимая форма Fas-рецептора (FasR) sFASL (soluble)–растворимая форма Fas-лиганда (FasL) |
