ПЦР - анализ в клинической лаборатории (стр. 2 )

l  комплементарность, когда в двойной спирали две полимерные цепи ДНК связаны бок о бок водородными связями за счет образования пар Г–Ц, Ц–Г, А–Т и Т–А;

l  антипараллельность комплементарных цепей – две полинуклеотидные цепи идут в противоположных направлениях: 5’-конец одной нити соответствует 3’-концу второй нити.

Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. В живой клетке этот процесс происходит следующим образом: с помощью специальных ферментов – гираз – происходит раскручивание спирали в том ее участке, где должна происходить репликация. Далее водородные связи, связывающие нити, разрываются и нити расходятся. Одна из цепей (“+”) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении - от 5'-конца к 3'-концу. Этот процесс осуществляется по принципу комплементарности ферментом ДНК-полимеразой. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока – небольшого начального двухцепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК (праймера) с комплементарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. Репликация одновременно идет и на второй нити ДНК (“-”), только в этом случае наращивание цепи происходит в обратном направлении. В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить синтезируется от материнской молекулы ДНК, а вторая – дочерняя, вновь синтезированная.

МЕХАНИЗМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ПЦР

Праймеры

Праймеры – искусственно синтезированные короткие, длиной 20–30 оснований, одноцепочечные ДНК (дезоксиолигонуклеотиды), комп­ле­мен­тар­ные 3’-концам цепей искомой ДНК-матрицы. В геноме искомого организма выбирается консервативная (редко подвергающаяся генетическим перестройкам), строго специфическая нуклеотидная последовательность. К ней синтезируются специфические праймеры. Таким образом, фрагмент молекулы, который будет фланкировать (ограничивать) праймер, должен присутствовать только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене человека и отсутствовать в ДНК других возбудителей болезней или других генах человека. Правильно подобранные праймеры играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации и обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

Полимераза

Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов. Для определения РНК-содержащих вирусов используется фермент обратная транскриптаза, который по РНК-матрице синтезирует ДНК-копию, которая затем участвует в ПЦР.

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

Строительный материал для синтеза комплементарных цепей (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ).

Ионы двухвалентных металлов

Ионы Mg2+ являются необходимым кофактором для ДНК-полимеразы.

Буферы

В стандартной ПЦР используются солевые буферы на основе 10–70 мМ “Трис-HCl” при рН 8–9 (20 oC). В буфер добавляются активаторы ПЦР – соли хлорида калия или сульфат аммония и стабилизаторы ДНК-полимераза – бычий сывороточный альбумин или желатин, а также неионные детергенты “Triton X100”, “Nonidet NP40” и “Tween 20”.

Анализируемый образец

Образец может быть подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК. Например, ДНК микроорганизмов, служащая мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

Циклический температурный режим

Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов (рис. 1).

Рис. 1. Этапы ПЦР-анализа.

1.  Денатурация. Расплавление спирали ДНК и расхождение нитей. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94–96 °C на 0,5–2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

2.  Отжиг. Присоединение праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают. При понижении температуры одноцепочечная ДНК стремится восстановить двухцепочечное состояние и, если в реакционной смеси есть мишень (искомая ДНК), то праймеры гибридизуются с мишенью. ДНК-праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно увеличен или амплифицирован. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50–65 °С. Время отжига 20–60 сек.

3.  Элонгация. Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом Тaq-полимеразой и проходит при температуре 70–72 °С. Время протекания синтеза 20–40 сек.

В ПЦР эти процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одного этапа реакции к другому достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании раствора до 93–95 оС происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу – присоединению или “отжигу” праймеров – инкубационную смесь охлаждают до 50–65 оС. Далее смесь нагревают до 70–72 оС – оптимум работы Тaq-ДНК-полимеразы. На этом этапе происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова. Многократное, или циклическое, повторение этой процедуры позволяет наработать значительное количество копий участка ДНК (ампликона).

СТАДИИ ПОСТАНОВКИ ПЦР

ПЦР-диагностика состоит из трех основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая сводится к выделению ДНК или РНК, проведению ПЦР (амплификации) и детекции продукта ПЦР. Для РНК-содержащих вирусов дополнительно проводят реакцию обратной транскрипции (получение кДНК, являющейся комплементарной вирусной РНК-матрице).

Пробоподготовка (выделение ДНК/РНК)

До начала работы необходимо подготовить пробы для выделения из них ДНК. Для этого сыворотку и плазму крови, мочу, синовиальную и спинномозговую жидкости, мазки и соскобы (доставленные в транспортной среде) концентрируют, мокроту разжижают, биопсийный и аутопсийный материалы аккуратно измельчают.

Процедура подготовки образца (ДНК, РНК) включает очистку образца от форменных элементов, лизис микроба, экстракцию (извлечение) ДНК из биопрепарата и удаление или нейтрализацию посторонних примесей, способных оказать ингибирующее действие на процесс реакции амплификации. Высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. Комплект реагентов для выделения НК должен обеспечивать эффективность экстракции ДНК/РНК (не менее чем 80–95 %) и высокую эффективность амплификации ДНК (в 100000 — 1000000 раз).

Существует два подхода при обработке проб: сложный и простой (табл. 2).

Таблица 2

Основные отличия методов выделения ДНК

Простые	Сложные
Высокие требования к забору материала	Упрощенные требования к забору клинического материала
Быстрое исполнение	Более трудоемкое
Низкая эффективность выделения ДНК	Высокая эффективность выделения ДНК/РНК
Низкая эффективность очистки от ингибиторов	Высокая эффективность удаления ингибиторов
	Возможность автоматизации

Сложный – используют с «грязными» пробами: с гемолизом и/или слизью, дебрисом и т. д. Метод направлен на выделение из образца чистых нуклеиновых кислот за счет их избирательной сорбции. Такая очистка ДНК достигается на специальных микроколонках или с помощью сорбентов, приготовленных на основе силикагеля. Выделение ДНК с помощью сорбентного метода является наиболее оптимизированной и технологичной процедурой пробоподготовки и позволяет увеличить чувствительность метода, что влечет за собой увеличение числа выявления возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах.

Простой – используют при работе с «чистыми» пробами, т. е. без гемолиза, слизи, дебриса и т. д. Метод подготовки проб состоит в простом лизисе исследуемого материала в сочетании с температурной обработкой. При его использовании формируется определенный процент ложноотрицательных результатов, что объясняется неполной экстракцией ДНК и присутствием ингибиторов реакции в пробе.

Существуют следующие подходы очистки нуклеиновых кислот.

1.  Использование детергентов для разрушения клеточных стенок и вирусных оболочек, растворения или связывания ингибиторов ПЦР (слизи, белков и др.).

2.  Адсорбция органических соединений и тяжелых металлов, присутствующих в крови и других клинических материалах больного, путем добавления в лизирующие растворы смол.

3.  Необратимая инактивация белков путем денатурации (протеазы, кипячение, хаотропные агенты).

4.  Высаливание ДНК из водного раствора в присутствии этанола (70 %), изопропанола (50 %), (1 мкг ДНК из 50 мкл водного раствора).

5.  Использование для разделения фаз вода-фенол. При этом ДНК/РНК остается в водной фазе, а белки переходят в фенольную фазу.

6.  Способность ДНК/РНК связываться с частицами силикагеля. Универсальный состав сорбента позволяет связывать максимальное количество ДНК и РНК широкого спектра молекулярных масс, гарантируя получение не менее 80 % высокоактивной тотальной ДНК.

Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Выбор конкретной методики особенно важен при анализе клеточного осадка мочи или гнойного отделяемого, так как эти образцы содержат большое количество субстанций, способных ингибировать ход реакции полимеризации ДНК-мишени.

Стандартным и ставшим уже классическим считается сорбентный метод получения чистого препарата ДНК/РНК. Сорбентный метод выделения ДНК/РНК в различных модификациях является наиболее предпочтительным для ПЦР-диагностики. Его преимуществом является возможность длительного хранения проб в замороженном состоянии, поскольку ДНК сорбируется на носителе и оттаивание проб не оказывает особого влияния на ДНК/РНК. Метод удобен, технологичен, является наиболее оптимизированной процедурой пробоподготовки, при которой достигается хорошая очистка ДНК. Этот метод позволяет увеличить диагностическую чувствительность и количество выявлений возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах.

На этапе экстракции ДНК/РНК важно обеспечить получение максимального количества высокоочищенной нуклеиновой кислоты. Показателями эффективности экстракции являются минимальные потери ДНК/РНК в процессе экстракции, максимальное удаление ингибиторов и нейтрализации нуклеаз, низкий риск перекрестной контаминации «от образца к образцу».

Для оценки эффективности экстракции комплект реагентов для выделения НК должен содержать внутренний контрольный образец (ВКО), который вносится в пробу на этапе экстракции ДНК/РНК и обеспечивает контроль качества проведения всех этапов анализа.

Амплификация

Амплификация в молекулярной биологии – увеличение числа копий ДНК. В клетке амплификация происходит в результате репликации ДНК. В искусственных условиях увеличения числа копий ДНК добиваются с помощью полимеразной цепной реакции (рис. 2).

Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n – число циклов амплификации. Если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30–40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле после соответствующего окрашивания.

Рис. 2. Схематическое изображение первого цикла ПЦР.

(1) - Денатурация при 94–96 °C; (2) - Отжиг при 68 °C ; (3) - Элонгация при 72 °C (P-полимераза); (4) - Закончен первый цикл.

Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. В ходе первого цикла ПЦР цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента нуклеиновой кислоты генома вируса, бактерий или человека. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза все новых и новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в реакционном растворе в геометрической прогрессии. ПЦР дает экспоненциальное увеличение специфического участка ДНК возбудителя.

Факторы, влияющие на эффективность амплификации

1.  Структура и концентрация праймеров.

2.  Структура матрицы.

3.  GC-состав.

4.  Концентрация магния.

5.  Активность ДНК-полимеразы.

6.  Концентрация ДНК искомого инфекционного агента.

7.  Неэффективный способ обработки биоматериала.

Одним из перспективных направлений в модификации амплификационного этапа является разработка систем, реализующих "твердофазную" амплификацию. В таких системах один из олигонуклеотидных праймеров ковалентно иммобилизован на специально модифицированном слое пластика пробирки. Получаемые в ходе ПЦР ампликоны также остаются иммобилизованными на твердой фазе, что исключает риск контаминаций и упрощает последующую процедуру их детекции. В последнее время большое внимание ученых обращено на дизайн амплификационных смесей, благодаря чему стало возможно применение мультипраймерной ПЦР, что увеличивает производительность и дает возможность выявления большего количества патогенных микроорганизмов или иных определяемых признаков, и в перспективе будет иметь большое значение при использовании в современных устройствах регистрации ДНК-биочипах.

Использование «горячего старта» при постановке ПЦР

Для оптимизации ПЦР, для повышения эффективности прохождения реакций, уменьшения риска образования неспецифических продуктов реакции амплификации используют подход, получивший название «горячий старт» (“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Специфичность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется температурой отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя двухцепочечные структуры. Температура отжига определяется длиной праймера и содержанием GC-пар и рассчитывается по следующей формуле: Tm =[(A+T) x 2] + [(G + C) х 4]. В зависимости от GC - состава и размера праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm), при которой образование водородных связей нестабильно. Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т. е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции.

Приборное обеспечение

ПЦР проводят в амплификаторе – приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, с точностью не менее 0,1 °C, который имеет совершенные характеристики переходных температурных процессов, увеличенный ресурс работы и обеспечивает значительное сокращение времени протекания реакции. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта» и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Характерной чертой современных амплификаторов является возможность поддержки пробирочного, планшетного и других форматов амплификации в одном приборе.

Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции и занимает от 2 до 3 часов.

Приборы оснащены программами, контролирующими аналитический процесс, поэтому количество лабораторных ошибок во время анализа минимально, а средства контроля качества наиболее развиты и реально применяются в практике ПЦР-лабораторий.

Регистрация результатов

Амплифицированный фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивый комплекс: он внедряется в «стопку» остатков азотистых оснований ДНК, составляющую сердцевину двойной спирали. В результате они оказываются в гидрофобном окружении, в котором бромистый этидий начинает флуоресцировать. В водной среде он этим свойством не обладает. Поэтому ДНК выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ светом с длиной волны 290–330 нм. В зависимости от размера образующихся в результате ПЦР-ампликонов используют гель с содержанием агарозы от 1,5 % до 2,5 %. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия. Охлажденную до 50–60 оС смесь заливают в форму слоем толщиной 4–6 мм и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. Гребенки устанавливают таким образом, чтобы между дном лунок и основанием геля оставался слой агарозы 0,5–1 мм. После застывания геля в карманы наносится амплификат в количестве 5–10 мкл. Рекомендуется параллельно с контрольными и опытными пробами проводить электрофорез смеси маркеров длин фрагментов ДНК. Обычно такая смесь содержит десять фрагментов ДНК длинной 100, 200, 300 и т. д. пар оснований. Постановка такой пробы позволяет верифицировать длину ампликонов в контрольных и опытных пробах. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза (рис. 3), заполненную буфером. Камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30–45 мин при напряженности электрического поля 10–15 В/см. При этом фронт красителя, входящего в состав реакционной смеси, должен пройти не менее 3 см.

Рис. 3. Камера для электрофоретических разделений ПЦР-продуктов

в агарозном геле.

Результаты оцениваются по наличию специфических фрагментов ДНК в агарозном геле. Специфичность синтезированного фрагмента ДНК подтверждается по его положению (размерам) относительно положительного ДНК-контроля, полосы которых устанавливаются на том же уровне в геле, что и полосы в образцах с положительным контрольным препаратом ДНК, видимых в агарозном геле в присутствии бромида этидия при УФ облучении.

После окончания электрофореза гель переносят на стекло трансиллюминатора и просматривают в ультрафиолетовом свете (рис. 4) и документируют.

В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность должна соответствовать длине ампликона, указанной в инструкции.

В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие специфического сигнала в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации – загрязнении используемых реагентов исследуемой ДНК или ампликоном.

Рис. 4. Свечение продуктов ПЦР-реакции в ультрафиолетовом свете.

В последнее время особенно много внимания уделяется модификации и модернизации методов регистрации результатов ПЦР. В целом можно выделить следующие принципиальные направления:

l  Внедрение систем, регистрирующих и анализирующих изображение геля в цифровом формате.

l  Гибридизационные методы регистрации результатов. В основе этих методов лежит гибридизация амплифицированной ДНК со специфичным к определяемой последовательности меченым олигонуклеотидным зондом и последующая детекция двуцепочечных ДНК. Применение гибридизационной схемы в детекции амплифицированной ДНК позволяет существенно повысить специфичность анализа, а плашечный формат выполнения делает возможным максимальную стандартизацию и автоматизацию процесса, что практически исключает субъективность оценки. Переход медицинских пользователей к гибридизационному формату регистрации будет во многом способствовать и дальнейшему внедрению диагностических систем нового поколения (рис. 5).

В основе технологии ПЦР в реальном времени лежит принцип флюоресцентной детекции продуктов ПЦР во время амплификации. Такая технология дает возможность осуществлять регистрацию непосредственно в реакционной пробирке, что исключает попадание продуктов реакции в окружающую среду и контаминацию лаборатории. Детектор амплификаторов может одновременно фиксировать свет от шести флюорофоров в 96 лунках и разделять сигналы от разных красителей. Это позволяет вести наблюдение за шестью амплификациями одновременно в каждой лунке одного планшета.

Рис. 5. График регистрации результатов ПЦР в режиме реального

времени (Quantitative real-time PCR).

ВОЗМОЖНОСТИ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Лабораторная диагностика имеет определяющее значение для установления причины инфекционного заболевания. Лабораторные исследования позволяют достоверно выяснить, каким именно возбудителем вызвано инфекционное заболевание, определить вирусную нагрузку, проследить иммунный ответ организма, правильно и своевременно назначить лечение, определить тяжесть течения болезни, проконтролировать эффективность лекарственной терапии.

При выборе метода для определения микроорганизмов, вызвавших инфекционный процесс, врачу-клиницисту надо хорошо ориентироваться в возможностях того или иного метода исследования, с тем, чтобы выбрать оптимальный подход (микробиологический, генодиагностический или иммунологический) для лабораторного исследования. Комплексное обследование пациента различными лабораторными методами дает возможность врачу-клиницисту получать более полную информацию как о наличии инфекционного агента, так и об иммунном статусе. Это позволяет более точно ставить диагноз, назначать соответствующее этиотропное лечение и вести последующий контроль терапии.

Условно все методы диагностики инфекций можно разделить (табл. 3) на две большие группы: прямые методы (выявления возбудителя) и непрямые (выявление эффекта). Прямое обнаружение возбудителя в клиническом материале является бесспорным доказательством инфекции и основанием для постановки этиологического диагноза.

Таблица 3

Классификация лабораторных методов в зависимости от

изучаемых объектов

Прямые методы	Непрямые методы
Микробиологический	Выявления антител
Выявления антигена	Инструментальный
Микроскопия	Гистологический
Генодиагностика (ПЦР)

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Достоинства. Возможность изучения целого ряда клинически важных фенотипических свойств микроорганизмов. Микробиологический метод по-прежнему является «золотым стандартом». Такие микроорганизмы, как грампозитивные кокки (Staphylococcus spp, Streptococcus.spp), грамнегативные кокки (Neisseria spp), грампозитивные палочки (Corynebacterium spp), грамнегативные палочки (Heamophilus spp, Pseudomonas spp), грибы (Candida spp), бактерии кишечной группы (Escherichia coli, Proteus spp. и др.) выявляются с помощью традиционных, доступных и достаточно легко воспроизводимых микробиологических и микроскопических методов.

Недостатки. «Некультивируемость» микроорганизмов, отсутствие адекватных сред или невозможность подбора условий культивирования для определенных микроорганизмов (вирусы и некоторые бактерии), длительность анализа, отсутствие высокопроизводительной техники идентификации и определения антибиотикорезистентности микроорганизмов, низкий уровень материальной базы бактериологических лабораторий. Ряд микроорганизмов, вызывающих воспалительные процессы в организме человека, таких как микобактерии туберкулеза, хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, можно выявить только с помощью очень трудоемких и дорогостоящих методов микробиологического исследования. Возбудителей с высокой антигенной изменчивостью или паразитирующих внутри клетки также трудно обнаружить классическими лабораторными методами. Наконец, разнообразные вирусы, например, вирус папилломы человека (HPV), герпес вирусы (VG), цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV) не могут быть выявлены с помощью микробиологических методов. Для их диагностики ПЦР-метод является оптимальным выбором.

Уровень развития микробиологической диагностики РФ остается одним из самых низких среди Европейских стран.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Этот метод, прежде всего, позволяет объективно выявлять реакцию организма человека в ответ на контакт с инфекционными агентами, выражающуюся в выработке специфических антител, обнаруживать специфический клеточный ответ, антитела IgG, IgM, IgA, а также антигены некоторых микроорганизмов.

Достоинства. Быстрота анализа, низкая стоимость, возможность стандартизации и автоматизации, достаточно высокая воспроизводимость результатов, высокая пропускная способность. Для определения некоторых микроорганизмов, например, Rubella virus иммунологический подход предпочтительнее других.

Недостатки. Непредсказуемая специфичность, необходимость в дублях при постановке реакции, необходимость наблюдения за титром антител в динамике для уточнения остроты процесса, низкая аналитическая чувствительность, поздняя сероконверсия, особенно актуальная для прямых методов ИФА «серологическое окно», перекрестные результаты ИФА у пациентов с циррозом печени, болезнями соединительной ткани, аутоиммунными заболеваниями, беременных и пожилых, а также (для косвенных методов ИФА) перекрестные результаты ИФА на антитела к другим микроорганизмам, ложноположительная реакция в случае циркуляции антител класса IgG у детей, рожденных от инфицированных матерей, вакцинации и при аутоиммунных заболеваниях.

МИКРОСКОПИЯ

Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), прямое выявление как корпускулярных, так и растворимых антигенов при люминесцентной микроскопии. Метод является скрининговым, так как его чувствительность и специфичность при использовании моноклональных антител, содержащихся в качественных импортных наборах, может составлять 60 % и 80 % соответственно. ПИФ недостаточно чувствительна для определения малых количеств элементарных телец, возможны как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты, поэтому этот метод предлагается использовать только как ориентировочный.

ГЕНОТИПИЧЕСКИЙ МЕТОД (ПЦР)

Для установления точного диагноза заболеваний, вызываемых различными инфекционными агентами, все чаще применяются современные методы молекулярной биологии.

Достоинства:

l  высокая аналитическая чувствительность и специфичность;

l  возможность получения результатов независимо от сложности культивирования микроорганизмов (выявления персистирующих, латентных и рецидивирующих форм инфекций);

l  специфичность и математически возможная диагностическая чувствительность;

l  возможность контроля эффективности лечения;

l  возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций;

l  возможность ранней диагностики инфекционных заболеваний у серонегативных пациентов, когда лечение наиболее эффективно;

l  возможность диагностики оппортунистических инфекций, часто протекающих на фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного ответа и протекания заболевания;

l  возможность разрешения сомнительных результатов серологических и эпидемиологических исследований;

l  возможность выявления наиболее патогенных штаммов инфекционных агентов;

l  возможность исследования инфекционности пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в терапии;

l  возможность определения резистентности к лекарственным препаратам;

l  возможность диагностики возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов;

l  возможность стандартизации и автоматизации анализа;

l  возможность увеличения исследуемого образца ДНК в сотни раз;

l  возможность проведения объективных качественных и количественных измерений;

l  возможность проведения “Multiplex ПЦР” (амплификация в одной реакционной среде нескольких ДНК-матриц с использованием нескольких пар праймеров).

Недостатки:

l  перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов;

l  контаминация продуктами амплификации (ампликонами), являющаяся наиболее частой причиной ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР-генодиагностики ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы.

Преимущества ПЦР перед другими методами клинической

лабораторной диагностики

Многие традиционные методы диагностики, например, иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что лишь опосредованно свидетельствует о наличии инфекции. При этом выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. У метода ПЦР существует ряд особенностей, большинство из которых являются несомненными достоинствами этого метода.

Универсальность процедуры выявления различных возбудителей

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это обусловливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов и дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы, кроме того, в качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические образцы. Наконец, вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) для его проведения используется стандартный комплект приборов.

Специфичность

Важное свойство ПЦР – ее высокая специфичность. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.