ПЦР - анализ в клинической лаборатории (стр. 5 )

Клиническое значение наиболее актуальных ПЦР - исследований, которые выполняются в Иркутском диагностическом центре, а также правила взятия материала для этих исследований более подробно представлены в приложении.

УПРАВЛЕНИЕ КАЧЕСТВОМ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЙ

Применительно к медицинским лабораториям понятие «качество» можно сформулировать следующим образом: качество лабораторных исследований – это правильно и своевременно назначенные тесты для нуждающегося в них пациента, выполненные на достаточном аналитическом уровне с необходимой информацией для их интерпретации.

ПЦР – высокотехнологический метод, требующий соблюдения строгих правил оснащения и организации работ в ПЦР-лабораториях, которые обобщены и сформулированы в нормативных документах. На основании этих документов проводится лицензирование деятельности лабораторий, занимающихся генодиагностикой.

ДОКУМЕНТЫ, РЕГЛАМЕНТИРУЮЩИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ

ГЕНОДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ

Основные документы, регламентирующие проведение ПЦР-анализа в КДЛ следующие:

1.  Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологи­ческих учреждений системы Министерства здравоохранения СССР № 000-81.

2.  Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Постановление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 01.01.01 г. “Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил” № 1.3.2322-08.

3.  Методические рекомендации, разработанные ЦНИИЭ, РНИПЧИ, ГИСК им. «Требования к планировке помещений и режиму работы в ПЦР-генодиагностической лаборатории».

4.  Методические указания МУ 1.3.1888-04 по организации работы при исследованиях методом ПЦР-материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности.

5.  Методические рекомендации по забору, транспортировке, хранению клинического материала для ПЦР-лаборатории. МЗ РФ ЦНИИЭ, 2005 г.

6.  Методические указания по применению дезинфицирующего средства «ДП-2Т». МЗ РФ, 2001 г.

7.  Работа с возбудителями туберкулеза и материалом, подозрительным на инфицированность возбудителем туберкулеза, осуществляется в соответствии с приказом МЗ РФ «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ПЦР-ЛАБОРАТОРИЙ

Согласно «Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения» и методическим указаниям, на этапе создания лаборатории для обеспечения качества ПЦР-исследований необходимы продуманные инженерно-планировочные решения, следует четко разграничивать ПЦР-лабораторию на "зоны" (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-реакции.

Руководствуясь этими документами, лаборатория молекулярной биологии ИДЦ разделена на следующие зоны (комнаты):

1.  Пре-ПЦР-помещение 1 (площадь 3,6 кв. м), которая предназначена для первичной обработки клинических образцов. Обработка клинических образцов производится в настольном боксе с ультрафиолетовыми лампами с вытяжной вентиляцией. После первичной обработки клинический материал инактивируется с лизирующим буфером, обеспечивающим полное обеззараживание материала, полное разрушение клеточных мембран и лизис клеток, не повреждая ДНК и не ингибируя ПЦР. Обеззараженные пробы переносятся в закрытых пластмассовых емкостях в пре-ПЦР-помещение 2. Остатки клинического материала, использованная посуда и другие загрязненные ДНК/РНК материалы на этапах первичной обработки собираются в закрывающиеся емкости, предназначенные для транспортировки, и переносятся в автоклавную. В автоклавной для создания асептических условий приточно-вытяжная система оснащена фильтрами тонкой фиксации.

2.  Пре-ПЦР-помещение 2 (площадь 34,5 кв. м) – с помощью лабораторной информационной системы (ЛИС) производится компьютерная сортировка поступивших проб на ПЦР-исследования, составление протоколов, выдача результатов лабораторных исследований. В кабинете имеется рабочая зона для выделения нуклеиновых кислот и боксированная зона для приготовления ПЦР-смеси, постановки ПЦР (внесение в подготовленные с ПЦР-смесью пробирки выделенных препаратов ДНК, РНК или кДНК). Настольные боксы оснащены ультрафиолетовыми лампами. По окончании работы все объекты-пробы убираются в холодильники. Клинические образцы и пробы, содержащие ДНК/РНК, хранятся отдельно от реагентов. На окнах предусмотрены жалюзи для защиты рабочих столов от попадания солнечного света. В кабинете установлен кондиционер в соответствии с санитарными правилами.

3.  Чистая комната (площадь 2,3 кв. м.) – для приготовления реакционных смесей.

4.  Пост-ПЦР-помещение. Здесь проводится электрофоретический анализ продуктов амплификации и документирование результатов с помощью видеосистемы. Комната находится в отдаленном от основных зон помещении, чтобы исключить контаминацию через движение воздуха из пост-ПЦР в пре-ПЦР-помещения. Работа ведется в одном направлении от пре-ПЦР-помещения к пост-ПЦР-помещению. Работа производится в одноразовой рабочей одежде. После проведения и обработки фотоизображений электрофорезов ПЦР - исследований и их архивации пробирки с продуктами ПЦР, использованные наконечники для автоматических пипеток, одноразовая одежда, перчатки и другие загрязненные ДНК-ампликонами материалы обрабатываются реагентами, вызывающими деградацию ДНК (1N HCI, гипохлорид Nа, 10% хлорная известь, 0,2%-ный раствор ДП-2Т) с экспозицией 120 мин. Окончательную дезактивацию использованных расходных материалов и реагентов (гель, буфер для электрофореза) производят в автоклавной комнате.

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ В ЛАБОРАТОРИИ

Рабочие помещения должны быть оснащены ультрафиолетовыми лампами с максимумом излучения в области 260 нм (типа ДБ-60) из расчета 2,5 Вт на 1 м3. Лампы должны быть расположены так, чтобы прямому облучению подвергались поверхности рабочих столов, оборудование и материалы, с которыми имеет контакт оператор во время проведения ПЦР-анализа. Облучение необходимо проводить в течение одного часа до начала работы и в течение одного часа после окончания работы.

Все кабинеты лаборатории оснащены в полном объеме емкостями для дезинфицирующих средств.

Работа должна проводиться в лабораторной одежде. В пост-ПЦР-помещении используется разовая рабочая одежда.

В пре-ПЦР и пост-ПЦР-помещениях должны работать разные сотрудники, чтобы избежать переноса продуктов амплификации на одежде и кожных покровах на этап пробоподготовки и тем самым исключить ложноположительные результаты исследований.

Каждое помещение и каждый сотрудник лаборатории имеет свой набор реактивов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате имеют соответствующую маркировку.

Пробирки и наконечники для автоматических пипеток при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку используются однократно. Наконечники используются только с аэрозольным барьером и обязательной сменой при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации.

Во время выполнения любого вида работ с ПБА запрещается оставлять рабочее место; сливать жидкие отходы (инфицированные жидкости, исследуемый материал и т. д.) в канализацию без предварительного обеззараживания.

Текущая уборка помещений проводится ежедневно влажным способом после окончания рабочего дня: в "чистой" зоне лаборатории с применением моющих средств, в "заразной" зоне – с применением дезинфектантов.

В конце работы обработка рабочих мест производится дезрастворами в соответствии с требованиями действующих нормативных документов, с последующей протиркой влажными одноразовыми салфетками для снятия остатков дезинфицирующего средства.

Остатки ПБА, использованная посуда, твердые отходы из "заразной" зоны лаборатории должны собираться в закрывающиеся емкости и передаваться в автоклавную или дезинфицироваться на месте. Методы и средства обеззараживания определяются в каждом отдельном случае в зависимости от ПБА и характера обеззараживаемого материала. Слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть запрещается.

Перенос ПБА и использованной посуды для обеззараживания должен осуществляться в закрывающихся емкостях.

По окончании работ медицинский персонал должен обработать руки дезинфицирующим раствором или 70% спиртом с последующим мытьем с мылом. Допускается использование кожных антисептиков в соответствии с инструкциями по применению.

Клинические образцы следует хранить отдельно от реагентов.

Для обработки и уборки рабочего места необходимо в каждом помещении иметь ватно-марлевые тампоны (салфетки), пинцет, дезинфицирующий и инактивирующий растворы (см. ниже).

Следует отметить еще одну особенность, затрудняющую исследования ДНК и РНК, это их высокая чувствительность к нуклеазам - ферментам деградации РНК и ДНК, которые могут обнаруживаться практически везде: на кожных покровах, на предметах лабораторного оборудования, реагентах, пластике. Поэтому пластик, используемый при работе с нуклеиновыми кислотами, сертифицирован на отсутствие РНКазной и ДНКазной активности. Кроме этого, пластиковые пробирки для амплификаторов должны иметь однородные тонкие стенки (для улучшения теплопроводности и сокращения времени циклов амплификации).

ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА В ХОДЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЙ

В процессе ПЦР-исследования, как любого лабораторного исследования, можно выделить три этапа: преаналитический, аналитический и постаналитический.

1.  Преаналитический этап включает в себя назначение врачом необходимых тестов, взятие материала, его центрифугирование и транспортировку образца в лабораторию, сортировку и аликвотирование образцов в лаборатории.

2.  Аналитический – пробоподготовку и исследование образца в лаборатории.

3.  Постаналитический – интерпретацию результатов анализа специалистом лабораторной диагностики, постановку диагноза и назначение лечения пациенту.

Надежность результатов исследования обеспечивается качеством его проведения на каждом из этапов: назначение исследования —> получение материала —> проведение исследования —> отчет о результатах исследования.

В настоящее время ПЦР-диагностика быстро развивается, что связано с внедрением новых технологий и обновлением приборного парка. Приборы оснащены программами, контролирующими аналитический процесс, благодаря этому количество лабораторных ошибок непосредственно во время анализа минимально. Кроме того, существует достаточно возможностей для внутри - и межлабораторного контроля качества, которые реально используются в практике ПЦР – лабораторий. При этом преаналитический этап в наименьшей мере находится под контролем лаборатории, т. к. значительная его часть проводится сотрудниками других подразделений ЛПУ. Так, причиной ошибочного диагноза, несмотря на безупречно проведенную процедуру анализа, могут быть: неправильная подготовка больного, нарушения процедуры взятия биологического материала у пациента, упущения при доставке материала в лабораторию, халатность или недостаточные знания при хранении и обработке проб.

Преаналитический этап

Зарубежная практика показывает, что важнейшим условием успешного лабораторного обследования пациентов и снижения количества лабораторных ошибок является стандартизация деятельности лаборатории и, прежде всего, процедур преаналитического этапа. Стандартизация предполагает разработку инструкций по операциям, использование которых на всех этапах ПЦР-анализа позволяет свести к минимуму вероятность возникновения ошибок.

Разработка инструкций на преаналитическом этапе должна включать следующие разделы работы:

1.  Показания для назначения врачом необходимых анализов.

2.  Подготовка пациента к обследованию.

3.  Взятие биологического материала в процедурном или смотровом кабинете (правильно выбранная стратегия забора материала обеспечивает эффективность ПЦР-диагностики).

4.  Маркировка пробы и заполнение направления.

5.  Условия транспортировки проб в лабораторию, сроки их доставки.

6.  Температурный режим и продолжительность хранения материала.

7.  Регистрацию направлений и материала.

8.  Порядок сортировки проб в лаборатории.

Существуют два вида ошибок на преаналитическом этапе при проведении ПЦР-анализа, которые ведут к неправильной постановке диагноза: ложноположительные и ложноотрицательные.

Ложноположительные результаты на преаналитическом этапе (положительный результат при отсутствии возбудителя в пробе) возникают в случаях:

l  контаминации (загрязнения) как в отдельных пробах, так и во всех пробах (тотальная контаминация). Она возникает при использовании инструментария, пробирок, перчаток и др. материалов, загрязненных искомыми микроорганизмами, чужой ДНК или ее копиями через предметы и реагенты. В результате обнаруживается "несуществующая" инфекция. Для ее устранения следует использовать одноразовый инструментарий;

l  неправильной тактики обследования пациента. Выявление микроорганизмов, не имеющих диагностического значения, которые могут присутствовать у здорового человека. Например, Neisseria ssp. в норме может существовать в полости рта и на других слизистых. Для уреаплазм, гарднерелл и других возбудителей значение имеют их количественные характеристики.

Рис. 9. Формализованный бланк направления,

включающий анализы методом ПЦР.

Ложноотрицательные результаты на преаналитическом этапе (отрицательный результат при наличии возбудителя в пробе) возникают в случаях:

l  неинформированности медицинского персонала по правильности забора клинического материала. Взятие материала должен осуществлять квалифицированный специалист. Перед началом работы следует ознакомиться с «Методическими рекомендациями по взятию, транспортировке, хранению и пробоподготовке биологического материала для ПЦР-диагностики»;

l  неосмысленного выбора биологического материала для ПЦР-исследования. Например, ДНК некоторых возбудителей неинформативно выявлять в крови (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonor­hoeae), осуществлять забор материала в период ремиссии (для инфекций, протекающих с периодами обострений и ремиссий) и т. д.;

l  загрязнения пробы примесями, ингибирующими ПЦР. Гепарин, продукты гемолиза эритроцитов и некоторые препараты для местного лечения способны ингибировать (тормозить) реакцию ПЦР. Поэтому забор материала должен проводиться до лечебных манипуляций;

l  разрушения ДНК во время неправильной транспортировки и хранения пробы. Например, цельную кровь нельзя замораживать;

l  взятия неинформативного мазка (недостаточное содержание в мазке эпителиальных клеток или содержание большого количества неинформативной слизи).

Использование лабораторной информационной системы (ЛИС) позволяет существенно уменьшить процент ошибок. Целесообразно автоматизировать процесс обработки направлений. Это можно сделать, формализовав направления и используя сканер для ввода информации в ЛИС. Немаловажную роль играет форма бланка-заявки на исследование, которая должна упрощать работу клиницистов, медсестер и лабораторных регистраторов. При регистрации в лаборатории правильно заполненная форма заявки считывается специальным сканером, и перечень назначенных врачом анализов автоматически переносится в лабораторную информационную систему, формируя заявку на исследования. На рисунке 9 представлена форма бланка ИОККДЦ, где для анализов методом ПЦР предусмотрены ячейки для заполнения (направляемый тип биологического материала).

Аналитический этап

Аналитический этап – первый этап, который осуществляется непосредственно в лаборатории.

Для качественного выполнения анализов необходимо современное передовое оборудование, квалифицированные специалисты, набор реагентов, имеющих высокую диагностическую чувствительность и диагностическую специфичность. Для контролирования качества выполняемых исследований проводится внутрилабораторный и внешний контроль качества, контроль оценки качества в ФСВОК – федеральной системе внешней оценки качества (Россия) и EQAS (США) - Международной системе оценки качества.

Применение метода ПЦР требует строгого соблюдения правил в организации работы и проведении всех этапов анализа.

Исследования материала от больного методом ПЦР проводят в учреждениях, имеющих разрешение на работу с патогенными биологическими агентами (ПБА) III–IV групп патогенности.

Исследования разделяются на три этапа и проводятся в трех изолированных помещениях (зонах) согласно «Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции».

Проведение ПЦР-диагностики инфекций связано с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, возможностью контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств ампликонов из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфической ДНК из образцов на этапе пробоподготовки приводит к появлению ложноположительных результатов.

Контроль качества ПЦР-исследований

Программы контроля качества, действующие в лабораториях, не обеспечивают 100%-ной гарантии от ошибок, в них содержатся тщательно разработанные требования по квалификации персонала, текущему обслуживанию и контролю состояния оборудования, а также другим стандартным операциям.

Помимо внутреннего, за лабораториями налажен внешний контроль со стороны федеральных и региональных органов контроля, а также профессиональных сертифицирующих организаций. Основные мероприятия, предусмотренные на каждом из этих трех этапов работы, представлены в таблицах ниже. Иногда, если результаты исследования не соответствуют другим данным, а состояние пациента нетяжелое и не требует экстренной помощи, врач может применить выжидательную тактику. В других случаях врач может повторить некоторые лабораторные исследования, чтобы убедиться в их соответствии исходному результату, либо в том, что результаты самостоятельно нормализовались.

Подтверждение информации – путем повторения исследований, контрольных исследований через некоторое время, получения второго или даже третьего мнения – особенно важно в случаях, когда предполагается тяжелое заболевание или планируется применение сложного метода лечения. Так, ставки очень высоки при подозрении на рак, СПИД, порок развития плода. Если предполагается проведение крупной операции, применение токсичного метода лечения, либо терапия может оказаться очень тяжелой или приводящей к необратимым осложнениям, в интересах пациента провести проверку результатов обследования, даже в случаях, когда время терять нельзя.

Как и в других случаях, врач должен тщательно взвесить также данные непосредственного обследования и анамнеза, чтобы понять, поддерживают ли они предполагаемый диагноз или противоречат ему.

Рис. 10. Бланк ФСВОК с результатом оценки выявления

вирусов гепатита С методом ПЦР.

Обязательным условием для успешного применения методов молекулярной биологии является понимание возможных ошибок на всех этапах анализа, их устранение или сведение к минимуму. Для этого при проведении ПЦР-исследований наряду с внутрилабораторным контролем качества проводится и внешняя оценка качества (рис. 10), ФСВОК (Россия).

Контроль качества исследований:

l  Осуществляется постоянно путем включения в каждую постановку ПЦР-реакции положительного, отрицательного и бланк-контролей (контроль качества выделения ДНК).

l  Периодически применяются собственные лабораторные положительные и отрицательные контроли, охарактеризованные и другими методами диагностики данной инфекции.

l  Применяются зашифрованные контрольные образцы ФСВОК (Федеральный стандарт).

l  Проверяется чувствительность и специфичность каждой новой серии диагностических наборов методом ПЦР, для стандартизации работы ПЦР тест-систем используются референс-панели.

l  Преимущество имеют ПЦР-наборы, укомплектованные внутренним контролем качества.

Отсутствие внутреннего контроля при рутинном клиническом ПЦР-исследовании приводит к увеличению ложноотрицательных результатов – в случае присутствия ингибиторов реакции.

Контроль реакции амплификации

Параллельно с опытными пробами ставятся контрольные образцы положительного и отрицательного контроля.

Положительный контроль – включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца вносится контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя. Положительный контрольный образец, используемый в каждой постановке ПЦР, должен соответствовать следующим требованиям:

l  быть стабильным в течение срока хранения тест-системы;

l  иметь точно измеренную концентрацию ДНК или РНК в препарате;

l  быть стерильным;

l  иметь аттестацию в ГИСК им. (наличие стандартных образцов производителя или отраслевых стандартных образцов).

Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации, а также позволяет исключить учет ложноположительных результатов.

Внутренний контроль ВКО

ВКО – это искусственно сконструированный препарат ДНК или РНК, имеющий те же сайты узнавания праймерами, что и ДНК или РНК микроорганизма, но размер амплифицированного ВКО превышает размер специфического ампликона. ВКО не должен конкурентно ингибировать в ПЦР при минимальных количествах ДНК микроорганизма.

Использование ВКО на этапе обработки клинического материала позволяет проверить качество проведения важных элементов ПЦР анализа:

1.  Контроль потерь ДНК/РНК и эффективность экстракции при обработке биологического материала.

2.  Контроль эффективности удаления ингибиторов ПЦР.

3.  Контроль работы лабораторного персонала.

Строгое соблюдение правил работы в ПЦР лаборатории позволяет обеспечить достаточную надежность лабораторных данных, что имеет огромное значение для оказания высококачественной медицинской помощи.

Проблема контаминации

Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты. При проведении ПЦР-анализа возможны две причины возникновения контаминации:

l  перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов;

l  контаминация продуктами амплификации (ампликонами), являющаяся наиболее частой причиной ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР – анализа ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся воздухом с пылью, с аэрозолями, а также через приборы или руки. Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхности лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложнопожительных результатов.

Для любой лабораторной методики основной проблемой является профилактика ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Существуют два вида ошибок на аналитическом этапе при проведении ПЦР-анализа: ложноположительные и ложноотрицательные.

Ложноположительные результаты на лабораторном этапе могут возникать при контаминации (загрязнении) как в отдельных пробах, так и во всех пробах (тотальная контаминация). Это наиболее трудно выявляемый вид ошибок.

Основной причиной ложноположительных результатов является так называемая перекрестная контаминация продуктами амплификации. В ходе постановки реакции амплификации происходит избирательное размножение участка ДНК (ампликона) искомого возбудителя. Количество ампликона в пробе при завершении реакции может достигать миллиардов копий. При неосторожном обращении с пробами после реакции амплификации, даже просто при открывании пробирки трудно избежать аэрозольного выброса макроколичеств реакционной смеси в атмосферу рабочего помещения. При этом может происходить контаминация воздуха, рабочей поверхности, перчаток, пипеток и т. д. Учитывая тот факт, что чувствительность реакции составляет единичные молекулы ДНК, а при аэрозольном выбросе возможно попадание в атмосферу сотен тысяч молекул, то очень высока вероятность попадания ампликона в исследуемые пробы. В этом случае получается положительный результат не вследствие наличия в пробе искомого инфекционного агента, а в результате размножения ампликона.

Ложноотрицательные результаты на лабораторном этапе возникают в случаях: потери ДНК во время неправильной транспортировки, при несоблюдении технологии выделения ДНК, при использовании некачественных реактивов. Добавление ВКО в пробу до выделения ДНК позволяет решить эту проблему. Ускоренные методы выделение ДНК также увеличивает вероятность потери ДНК/РНК, особенно заметные при работе с небольшими количествами ДНК в образце.

Одной из основных причин такого рода результатов является наличие в исследуемой пробе ингибиторов реакции. Чаще всего с такими результатами приходится сталкиваться при анализе клеточного осадка мочи или гнойного отделяемого, т. к. эти образцы содержат большое количество субстанций, способных ингибировать ход реакции полимеризации ДНК-мишени. Проверить наличие ингибиторов в исследуемой пробе можно путем добавления аликвоты пробы в образец с контрольной ДНК-мишенью, имеющейся в каждом наборе (ВКО). Если в результате проведенного эксперимента не получается ожидаемый фрагмент ДНК, значит исследуемый образец содержит ингибирующие компоненты. В этом случае необходимо еще раз тщательно отмыть образец, убедиться в высоком качестве реагентов, используемых для выделения ДНК и повторить реакцию амплификации.

Другая причина ложноотрицательных результатов - это низкая активность фермента Taq-полимеразы и деградация дезоксинуклеотидтрифосфатов или олигонуклеотидных праймеров, обусловленная неправильным хранением или частым замораживанием и оттаиванием реагентов.

Существует несколько способов борьбы с контаминацией:

l  одним из них является использование фермента N-урацил-глико­зилазы.

l  другим способом инактивации ампликонов служит фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, которые активируются кратковременным облучением ультрафиолетовым светом. Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не могут участвовать в реакции амплификации;

l  третьим – проблема ложноположительных результатов решается с помощью организационных мероприятий (см. выше).

Действия при возникновении контаминации

нуклеиновыми кислотами

1.  Сотрудников, проводящих деконтаминацию, обеспечивают одноразовыми халатами, тапочками, перчатками, одноразовой ветошью, емкостями для приготовления моющих и дезинфицирующих растворов.

2.  Каждую зону лаборатории обрабатывают работающие в ней сотрудники.

3.  Утилизируют все находящиеся в «контаминированной» зоне реактивы.

4.  Утилизируют исследуемые материалы на всех промежуточных стадиях обработки.

5.  Проводят обработку паром под давлением всей спецодежды «контаминированной» зоны.

6.  Каждую зону лаборатории разбивают на участки уборки. Для обработки каждой зоны используют новый набор уборочного инвентаря.

7.  Обработку проводят от участка к участку последовательно, каждый участок обрабатывают отдельной ветошью.

8.  Поверхности каждого участка вначале обрабатывают моющим раствором для удаления жировых загрязнений, после чего остатки моющего средства удаляют ветошью, смоченной водой.

9.  На поверхность наносят на 30 минут дезинфицирующий раствор 0,2% ДП-2Т или аналогичный ему, разрешенный к применению для этих целей в установленном порядке. Остатки дезинфицирующего средства тщательно удаляют ветошью, смоченной водой.

10.После завершения указанной обработки проводят обеззараживание ультрафиолетовым излучением влажных поверхностей в течение одного часа.

11.Дезинфекцию дезрастворами с обработкой помещения ультрафиолетом повторяют еще раз.

12.Каждый последующий этап обработки проводят в новой одноразовой одежде с использованием новой ветоши. Для удаления остатков нанесенных на поверхность дезинфицирующих средств ветошь тщательно прополаскивают в чистой воде, обрабатываемую поверхность протирают несколько раз. После каждого этапа обработки ветошь утилизируют.

13.По завершении деконтаминации берут повторные смывы, которые исследуют на наличие НК возбудителей инфекционных заболеваний, диагностику которых осуществляют в данной лаборатории.

14.Для проведения смывов стерильный зонд смачивают в физиологическом растворе или ТЕ-буфере, после чего вращательными движениями протирают рабочие поверхности оборудования, мебели, дверных ручек и косяков, телефонов и т. п.

15.В случае получения в образцах смывов положительных результатов ПЦР-анализа обработку повторяют.

16.Загрязненный расходный материал утилизируют.

17.Случаи контаминации регистрируют в специальном журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов внутрилабораторного контроля.

18.Проведение ПЦР-исследований до завершения деконтаминационных мероприятий не допускается.

Постаналитический этап

Все результаты, выходящие за пределы референсных значений, просматриваются врачом-лаборантом или врачом-аналитиком. Результаты, вызывающие подозрение или не укладывающиеся в какую-либо клиническую картину, просматриваются, и в случае необходимости принимаются решения о перестановке анализа или выдаче результата с сопроводительной записью. С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа (табл. 6).

Таблица 6

Ошибки, встречающиеся при проведении ПЦР-диагностики

Характер ошибки	Причина ошибки	Следствие ошибки	Возможность лабораторного контроля ошибки	Способы предотвращения ошибки
Контаминация пробы на стадии забора материала	Использование при заборе пробы инструментария, пробирок, перчаток и др. материалов, загрязненных “положительной” ДНК	Ложноположительный результат	Невозможен	Использование разового инструментария и материалов; повышение образовательного уровня медицинского персонала
Загрязнение пробы примесями, ингибирующими ПЦР	Проба содержит примеси ингибиторов ПЦР. Сильными ингибиторами являются гемоглобин, гепарин	Ложноотрицательный результат	Осуществляется при использовании тест-систем с внутренним контролем	Использование разового инструментария и материалов; соблюдение правил забора материала
Забор материала выполнен неадекватно, в пробе отсутствуют клеточные структуры.	Несоблюдение правил забора материала (вместо соскоба клеток собрана поверхностная слизь)	Ложноотрицательный результат	В некоторых случаях возможен при визуальном контроле	Соблюдение правил забора материала; использование специальных одноразовых щеточек-зондов
Разрушение ДНК при транспортировке и хранении пробы	Несоблюдение правил транспортировки и хранения проб	Ложноотрицательный результат	Невозможен	Соблюдение правил транспортировки и хранения проб
Потери ДНК во время пробоподготовки	Несоблюдение инструкции выделения ДНК; использование некачественных реактивов	Ложноотрицательный результат	Возможен при проведении положительного образца через все стадии пробоподготовки	Соблюдение инструкции выделения ДНК; использование качественных реактивов
Контаминация в отдельных пробах	Нарушение правил работы в ПЦР - лаборатории; использование одного наконечника при обработке разных проб; при внесении реагентов наконечник касается стенок пробирки; загрязнение дозатора	Ложноположительный результат	Возможен при постановке параллельных проб	Соблюдение правил работы в ПЦР - лаборатории; инструкции выделения ДНК и постановки ПЦР; использование наконечников с фильтрами
Тотальная контаминация	Загрязнение реагентов, дозаторов “положительной” ДНК	Ложноположительный результат	Осуществляется при постановке отрицательного контроля	То же

Поскольку эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего забор проб, т. к. именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Как показывает практика, при соблюдении правил работы и выполнении требований инструкций во время постановки ПЦР вероятность ошибок невысока.