ПЦР - анализ в клинической лаборатории (стр. 4 )

Гепатит D (ВГD)

Возбудитель HDV является уникальным среди всех вирусов гепатита, а также самым вирулентным. Как вирус он неполноценен, т. к. не может реплицироваться и инфицировать человека, не зараженного вирусом гепатита В. Чтобы репродуцироваться в организме человека, вирусу гепатита D необходима внешняя оболочка вируса гепатита В (HВV). HDV состоит из РНК, внутреннего антигена (HDAg) и внешней оболочки, состоящей из HBsAg. HDV встречается только у улиц, инфицированных возбудителем гепатита В.

Вирус гепатита HDV, так же, как и вирус гепатита В, передается через кровь и жидкости организма. Симптомы гепатита HDV идентичны с проявлениями других форм вирусных гепатитов и включают в себя желтуху, лихорадку, недомогание, темную мочу и тошноту. Несмотря на то, что симптомы сходны, заболевание гепатитом HDV протекает в более тяжелой форме, чем заболевание только гепатитом В. Основной особен­ностью патогенеза HDV-инфекции является ведущая роль HDV по сравнению с HBV. При этом активная репликация HDV чаще приводит к подавлению репродукции HBV.

Существуют два типа инфицирования: коинфицирование и суперинфицирование вирусом гепатита HDV.

Коинфицирование происходит, если пациент одновременно инфици­руется вирусом гепатита HDV и вирусом гепатита HBV.

Суперинфицирование происходит, если больной с хроническим инфицированием вирусом гепатита HBV заражается вирусом гепатита HDV. У таких пациентов, как правило, наблюдается внезапное ухудшение состояния при заболевании печени.

У пациентов с гепатитом HBV, которые инфицируются вирусом гепатита HDV, течение хронического гепатита становится более агрес­сивным и наблюдается очень высокий уровень цирроза и развития терминальных стадии заболеваний печени, что делает такое суперинфицирование чрезвычайно опасным.

Гепатит С (HCV)

Инфицирование гепатитом С является одной из основных причин развития хронических (до 85%) диффузных заболеваний печени и гепатоцеллюлярной карциномы (первичного рака печени). Отличительной особенностью ВГС является многолетнее латентное или малосимптомное течение по типу так называемой медленной вирусной инфекции. В таких случаях заболевание большей частью долго остается нераспознанным и диагностируется на далеко зашедших клинических стадиях, в том числе на фоне развития цирроза печени и первичной гепатоцеллюлярной карциномы.

В настоящее время наиболее распространенным методом лабораторной диагностики гепатита HСV является иммуноферментный анализ, направленный на выявления специфических антител в сыворотке крови. При использовании тест-систем даже 3-го поколения, считающихся наиболее чувствительными и специфичными, не всегда удается своевременно поставить диагноз. В большинстве случаев это связано с существованием «серологического окна». Этот период может продолжаться от 3 недель до 6 месяцев. Кроме того, наличие антител к вирусу гепатита HСV не свидетельствует о наличии заболевания. Тест-систем для выявления антигенов вируса гепатита HСV в настоящее время в практическом здравоохранении нет.

Одним из основных маркеров активности патологического процесса является репликация вируса, для доказательства которой необходимо выявление самого вируса или его компонентов. РНК HCV обнаруживаются в сыворотке крови уже в течение первой недели после инфицирования.

Учитывая неуклонный рост заболеваемости вирусным гепатитом HCV, проблема этиологической диагностики этого заболевания становится все более актуальной.

ПЦР играет ведущую роль в диагностике гепатита С, позволяя:

1.  Установить факт инфицированности гепатитом С и выявить смешанные формы HСV/HВV и HCV/HGV. При микст - инфекции вирусы гепатитов HCV и HBV оказывают взаимное влияние на течение инфекционного процесса. HВV подавляет развитие HСV за счет стимуляции в организме больного неспецифических цитокинов. С другой стороны, коровский белок HСV подавляет репликацию HВV, связываясь с прегеномной РНК HВV, препятствуя ее упаковке. При коинфекции вирусом гепатита HGV в подавляющем большинстве исследований наблюдался менее выраженный синдром цитолиза. Подобный феномен благоприятного влияния HGV описывают у пациентов с ВИЧ-инфекцией, у которых коинфекция вирусом гепатита HGV способствовала замедлению развития СПИД (дискутабельные данные).

2.  Установить наличие показаний к противовирусному лечению, а также выбрать оптимальную схему лечения. Решить эти вопросы помогают количественное определение уровня РНК HCV (при низкой вирусной нагрузке эффективность лечения выше) и определение генотипа HCV (генотип 1 хуже отвечает на противовирусную терапию по сравнению с генотипами 2 и 3). Наличие генотипа 1, высокий уровень виремии ассоциированы с продолжительностью заболевания и тяжестью печеночных изменений.

3.  Оценить эффективность проводимого лечения. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель, но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводимой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на двенадцатой неделе лечения.

4.  оценить устойчивость ответа на лечение. Для этого проводят обнаружение РНК HCV через 24 недели и через 72 недели после окончания лечения.

Рис. 6. Преимущества выявления HCV количественным метода ПЦР в реальном времени перед качественным методом.

В настоящее время успешно реализуются количественные методы ПЦР-анализа. Хорошим прогностическим признаком при назначении терапии является низкий уровень виремии – менее 30000 ME/мл. Количественный ПЦР-тест является информативным параметром отклика пациента на терапию (рис. 6).

При проводимой терапии понижение вирусной нагрузки является явным маркером того, что пациент хорошо реагирует на выбранные лекарственные препараты и их дозу. В случае, когда в течение трех месяцев не происходит значимого уменьшения уровня вирусной нагрузки (в 100 и более раз), обычно рекомендуется изменение дозы или смена препарата и схемы лечения. В связи с этим важно постоянно контролировать ход лечения. Количественное определение РНК вируса гепатита С в плазме крови во время лечения является необходимым исследованием и позволяет врачам выбрать оптимальную схему лечения для каждого пациента.

Использование ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии

В пульмонологии методы ДНК-анализа применяются для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, рецидивирующих хронических бронхитов, туберкулеза легких.

Обнаружение микобактерий туберкулезного комплекса в клинических образцах является одним из основных диагностических подходов во фтизиатрии. В настоящее время классические методы выявления возбудителя по своей эффективности уже не удовлетворяют клиницистов. Быстрый метод бактериоскопии обладает низкой чувствительностью: для обнаружения микобактерий туберкулеза необходимо, чтобы 1 мл материала содержал не менее 100 тыс. микробных клеток. Люминесцентная микроскопия увеличивает чувствительность бактериоскопии на 10-30 %. Чувствительность бактериологического посева значительно выше – 20-100 микробных клеток, однако исследование занимает длительное время – один – три месяца. Морфологическая диагностика сложна, так как требует получения биоптата из пораженного органа, либо заставляет идти на диагностическую операцию. В связи с этим микобактерии туберкулеза выявляют в среднем лишь у 50-60 % больных активным туберкулезом.

Методы диагностики с использованием серологических тестов – ИФА, РИА, РПГА, латекс-агглютинация и др. - имеют сомнительное диагностическое значение вследствие их низкой чувствительности и специфичности. Антитела к микобактериям в том или ином количестве присутствуют в крови не только больных, но и здоровых инфицированных людей. Титры антител в сыворотке крови больных активным туберкулезом и титры антител у людей с неактивным туберкулёзом зависят от состояния иммунной системы пациента и особенностями течения болезни, связанной с давностью инфицирования или тяжестью заболевания. Кроме того, бактерии могут находиться в мембранной упаковке (в фагосоме), в которой антигенные детерминанты микобактерий скрыты от иммунной системы и на фоне тотальной вакцинации населения БЦЖ имеют сомнительное диагностическое значение. Поэтому все большее значение приобретают альтернативные и дополнительные методы. Совершенствуются методы культивирования микобактерий. Примером может служить радиометрический метод с использованием системы “BACTEC”, сокращающий время бактериологического исследования туберкулеза до 10-20 дней. Для эффективного выявления M. tuberculosis в клинических образцах применяется метод полимеразной цепной реакции. Метод ПЦР позволяет дифференцировать виды бактерий, что облегчит диагностику атипичных случаев туберкулеза (микобактериозы), часто имеющих сходную с туберкулезом клинико-рентгенологическую картину. ПЦР имеет несомненное преимущество, поскольку не дает неспецифических реакций. Метод ПЦР сочетает в себе высокую чувствительность, которая не уступает культуральному методу и равна 2-50 копий генома, и высокую оперативность (время проведения анализа - 6-8 часов). В настоящее время разработаны и появились на рынке ПЦР-наборы для определения устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам и для дифференциальной диагностики микобактерий.

Молекулярно-биологическим методам исследования туберкулеза придается важная роль в повышении эффективности выявления и дифференциальной диагностики туберкулеза, контроле диспансерных больных, улучшении системы эпиднадзора за туберкулезом.

Частой причиной атипичных пневмоний, рецидивирующих хронических бронхитов являются микоплазмы, хламидии и вирусные агенты. Диагностика этих возбудителей традиционными методами микроскопии и бакпосева неэффективна. ПЦР позволяет не только диагностировать хламидиозы и микоплазмозы, но и проводить видовую идентификацию возбудителя (С. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae и др.).

Применение ПЦР в урогинекологической практике

Наиболее эффективно и экономически обосновано использование метода в урогинекологической практике для выявления ВПЧ, хламидиоза, микоплазмозов, хронической гонореи, герпеса, гарднереллеза.

В гинекологии ПЦР-анализы – обязательная диагностическая процедура, входящая в профиль обследований различных женских заболеваний, в первую очередь, для диагностики широкого спектра заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП). Так методами ПЦР может быть диагностировано большинство инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) (табл. 5).

Большинство вышеперечисленных инфекций протекает со схожей симптоматикой и может приобретать затяжное, хроническое течение, что приводит к развитию осложнений (воспалительные заболевания органов малого таза, нарушение репродуктивной функции, осложнения в процессе беременности и др.).

Таблица 5

Возбудители урогенитальных инфекций

Патогенные микроорганизмы возбудители ИППП	Условно-патогенные микроорганизмы урогенитального тракта
Treponema pallidum	Mycoplasma homnis
Neisseria gonorrhoeae	Ureaplasma urealyticum
Chlamydia trachomatis	Ureaplasma parvum
Mycoplasma genitalium	Gardnerella vaginalis
Trichomonas vaginalis	Candida spp.
Вирусы герпеса (HSV 1,2)	Другие микроорганизмы, ассоциированные с бактериальным вагинозом
Вирусы папилломы человека (HPV)

Воспалительный процесс урогенитального тракта может протекать с участием нескольких возбудителей. При этом этиологические агенты, вызвавшие инфекционный процесс, могут быть выявлены только на основании прямых лабораторных методов.

Основные клинические синдромы и урогенитальные инфекции

Уретрит – воспалительное заболевание мочеиспускательного канала. За развитием уретрита стоят патогенные микроорганизмы, возбудители ИППП – гонококки, хламидии, трихомонады, вирусы простого герпеса 1 и 2 типов, а также условно-патогенная флора. Традиционно при диагностике уретрита используются мазки, полученные из дистального отдела уретры, где чаще всего локализован воспалительный процесс. В тоже время инфекция может распространяться на верхние отделы уретры, недоступные для получения с помощью стандартной процедуры. В этом случае исследование первой порции мочи с помощью высокочувствительного метода амплификации нуклеиновых кислот может способствовать выявлению возбудителя и установлению этиологии инфекции.

Цервицит – воспаление слизистой оболочки шейки матки. Инфекционный цервицит чаще возникает при заболеваниях, передающихся половым путём. Его могут вызывать хламидии (Chlamydia trachomatis), гонококки (Neisseria gonorrhoeae), ВПГ, трихомонады (Trichomonas vaginalis), реже - другие микроорганизмы.

Бактериальный вагиноз (БВ) – инфекционный невоспалительный синдром различной этиологии, обусловленный резким снижением перекись-продуцирующих лактобактерий и замещением их кокко-бациллярной микроаэрофильной (G. vaginalis) и анаэробной (Bacteroides spp., Prevotella spp., Mobiluncus spp., Atopobium vaginae и др.) флорой. БВ не относится к ИППП, а является проявлением дисбиоза влагалищного биотопа. Маркерами бактериального вагиноза является снижение лактофлоры и увеличение Gardnerella vaginalis. Лактобактерии формируют своеобразный барьер на пути распространения патогенных микробов.

Проблемы патологического состояния шейки матки привлекает к себе большое внимание врачей-гинекологов ввиду высокой распространенности и трудности диагностики.

Вирус папилломы человека (ВПЧ) – широко распространенная и очень вариабельная группа вирусов, обладающих онкогенным потенциалом. Вирусы папилломы передаются только при тесном контакте с инфицированным или пораженным эпителием. Клетками-мишенями для ВПЧ являются эпителиоидные клетки кожи и слизистой оболочки. Вирусы могут оказывать на эпителий продуктивное и трансформирующее воздействие. При продуктивном воздействии возникают доброкачественные новообразования, при трансформирующем – дисплазии тяжелой степени, прогрессирующее развитие которых приводит к раку. Среди генитальных типов особенно актуальными являются типы вируса, обладающие высокой трансформирующей активностью по отношению к эпителиальной клетке и способные провоцировать развитие злокачественных новообразований, в том числе, рака шейки матки.

Не каждая инфицированная женщина заболевает раком. По литературным данным, до 90% случаев инфицирования ВПЧ заканчиваются спонтанным выздоровлением, однако в 10% случаях развивается персистирующая инфекция, которая и запускает механизмы злокачественной трансформации эпителиальных клеток.

Интеграцией вирусной ДНК в геном клетки хозяина и ее опухолевая трансформация чаще возникает при ослаблении иммунной системы, при взаимодействии ВПЧ с другими канцерогенными или инфекционными агентами (вирус простого герпеса 2 типа, Ch. trachomatis, цитомегаловирусы и др.).

В последние годы получены новые данные на молекулярном уровне, подтверждающие онкогенность вируса папилломы. Установлено, что белки Е6 и Е7, кодируемые HPV, способны вызывать клеточную трансформацию. Показано, что белок Е7 взаимодействует с клеточным белком р53, супрессором трансформации клеток, и вызывает его деградацию, что открывает путь к перерождению инфицированной вирусом клетки, неконтролируемому делению измененных клеток и приводит к образованию обширных участков пораженного эпителия шейки матки. Наличие белка Е7 в цервикальных пробах может рассматриваться как однозначное свидетельство начавшегося процесса малигнизации эпителиальных клеток, содержащих интегрированную копию генома ВПЧ.

Прогнозы по поводу онкогенной трансформации при инфицировании вирусом зависят от типа вируса и физического состояния его ДНК.

Лабораторная диагностика папилломовирусной инфекции, направленная на раннее выявление носительства вируса, является важным инструментом, позволяющим контролировать распространение инфекции и своевременно назначать комплексные лечебно-профилактические мероприятия, предупреждающие развитие онкологических осложнений. Однако использование этого метода приводит к некоторой гипердиагностике, т. к. примерно в 80 % случаев инфицирование ВПЧ имеет кратковременный характер и заканчивается спонтанным выздоровлением и элиминацией вируса. В связи с этим положительный результат при лабораторном исследовании на ДНК ВПЧ не позволяет в большинстве случаев прогнозировать развитие цервикального рака.

Вирус папилломы человека подразделяется на две большие группы. Первая вызывает образование папиллом. Вторая ассоциируется с предопухолевыми заболеваниями и раком шейки матки. Поэтому при наличии фоновых заболеваний шейки матки и присутствии вируса папилломы человека высокого канцерогенного типа повышается вероятность опухолевых заболеваний шейки матки. В таком случае необходимо ежегодное профилактическое обследование, включающее кольпоскопию и онкоцитологическое исследование соскоба с шейки матки. Кроме того, необходимо проведение лечения, направленного на укрепление общего и местного иммунитета и нормализацию микрофлоры влагалища.

ПЦР диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекций является актуальной для акушерско-гинекологической практики, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, пульмонологии, офтальмологии, неврологии. Материалом для вышеперечисленных возбудителей могут служить аспираты, носоглоточные смывы, соскобы из зева, моча, мазки из уретры, вагины и цервикального канала, соскобы клеток конъюнктивы и спинномозговая жидкость.

Chlamydia trachomatis вызывает урогенитальную хламидийную инфекцию. Первоначальным очагом инфекции чаще всего является слизистая уретры у мужчин и канала шейки матки у женщин. Кроме того, Ch. trachomatis может поражать и другие слизистые, покрытые цилиндрическим эпителием (прямая кишка, конъюнктива глаза и глотка). Ch. trachomatis могут обнаруживаться в синовиальной жидкости.

Для женщин хламидийная инфекция представляет наибольшую угрозу из-за слабо выраженной симптоматики и связанными с этим поздней диагностикой и несвоевременным назначением лечения. Ch. trachomatis может являться одной из причин развития вторичного бесплодия у женщин. Показано, что выделяемый хламидиями при хроническом течении заболевания белок теплового шока, сходный по своему аминокислотному составу с человеческим, способен вызывать аутоиммунные процессы в области органов малого таза и развитие бесплодия. Кроме того, Ch. trachomatis может привести к появлению антиспермальных антител, что является еще одной причиной бесплодия.

У новорожденных от матерей, больных урогенитальным хламидиозом, может развиваться хламидийный конъюнктивит, уретрит, вульвовагинит, артрит и поражения других органов.

Гонорея – инфекционное заболевание, передаваемое половым путем, возбудителем которого является гонококк (Neisseria gonorrhoeae). В большинстве случаев заражение происходит при половом контакте. Как правило, источником заражения бывают женщины, т. к. у них заболевание может протекать бессимптомно и трудно диагностируется. Бытовой способ заражения заражение (через белье, полотенце, мочалку, посуду, воду в бассейне) встречается крайне редко, т. к. гонококковая инфекция не может существовать вне организма человека и, кроме того, бытовой способ заражения не дает возможности необходимому количеству гонококков попасть в организм.

Все половые партнеры больного гонореей должны пройти обследование, а в случае необходимости, и лечение. Отсутствие каких-либо симптомов венерической болезни еще не означает, что ее нет. Подтвердить отсутствие гонококковой инфекции можно только лабораторно. Без соответствующего лечения возможны серьезные поражения органов малого таза.

Заражение новорожденного возможно от больной матери в процессе родов. У детей, зараженных во время родов гонококком, поражаются глаза, что может приводить к слепоте.

Трихомониаз – заболевание мочеполового тракта, возбудителем которого является трихомонада (Trichomonas vaginalis). В последнее время трихомониаз получил широкое распространение. Чаще всего им заболевают женщины детородного возраста от 16 до 35 лет. Большой процент больных составляют лица, страдающие другими венерическими заболеваниями и часто меняющие половых партнеров.

Заражение трихомониазом происходит в основном половым путем, бытовым путем заразиться практически невозможно. Однако в сперме, моче и воде возбудитель остается жизнеспособным в течение 24 часов. У больных или у тех, кто перенес эту инфекцию, вырабатываются сывороточные и секреторные антитела, которые указывают на возбудителя, но иммунитета на трихомонадную инфекцию не развивается.

Диагностика трихомониаза осуществляется на основании клинических признаков и лабораторных исследований. Для получения более точного результата применяется сразу несколько методов, а материал для изучения берется из различных очагов воспаления.

Генитальный герпес вызывает вирусы простого герпеса I и II типов

Герпетическое поражение половых органов является одним из наиболее распространенных заболеваний в сфере клинической вирусологии. Вирус герпеса I типа практически идентичен вирусу герпеса II типа. Разница между ними заключается в строении поверхностных белков – гликопротеидов (gC, gG).

Вирусы герпеса человека передаются при контакте через кожу, слизистые оболочки, гениталии, глаза и легкие. Вирус простого герпеса I типа обычно вызывает поражения, локализованные в верхней части тела (губы, лицо, руки, туловище). ВПГ-II поражает, как правило, область гениталий. Однако в последние годы многие клиницисты наблюдают стирание границ в отношении анатомического тропизма вирусов, что проявляется в обнаружении ВПГ-II при поражении слизистых полости рта и ВПГ-I при поражении гениталий. Генитальный герпес характеризуется рецидивирующим течением и невозможностью полного исцеления. Клинически проявляющийся у матери генитальный герпес является источником инфицирования плода во время родов и вызывает развитие неонатального герпеса. Возможен и трансплацентарный путь передачи инфекции. В этом случае развивается генерализованная форма с тяжелыми поражениями не только кожных покровов, но и внутренних органов: печени, селезенки, надпочечников, головного мозга.

До недавнего времени большинство методов лабораторной диагностики герпетических инфекций являлись серологическими. Однако эти методы имеют лишь относительную диагностическую ценность и не позволяют с достаточной степенью достоверности установить этиологию той или иной формы болезни.

Учитывая, что симптоматика герпеса может быть схожа с симптоматикой других инфекций, передающихся половым путем, одной из главных задач является идентификация заболевания.

Материалом для исследования может служить содержимое везикул, взятое из очага поражения, пробы из уретры или цервикального канала, кровь или слюна.

Криминология

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Метод геномной идентификации личности основан на том, что в ДНК человека имеются полиморфные локусы, часто имеющие 8–10 аллелей. Определение набора этих аллелей для нескольких полиморфных локусов (7–15) у конкретного индивида позволяет получить для него своего рода "геномную карту", характерную только для этого человека. Необходим образец генетического материала с места преступления: кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически – одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью гель-электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint). Этот прием используется при анализе экологических проблем, когда требуется знать точный характер родственных связей в популяции. Например, использование генетического фингерпринта может позволить оценить число основателей достаточно молодой популяции. Благодаря этому приему стало возможно исследовать характер взаимоотношений между поколениями: происходит ли преимущественно конкуренция между предками и их прямыми потомками, или наоборот, усиленное расселение на далекие расстояния делают такую конкуренцию менее вероятной. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Установление отцовства

В генотипе каждого ребенка присутствуют аллели, унаследованные от биологических родителей. В основе метода геномной идентификации личности лежит изучение аллелей, уникально наследуемых ребенком от биологических родителей (ряд не сцепленных между собой полиморфных локусов, представленные в геноме человека дискретным числом тандемно повторяющихся единиц ДНК-последовательности VNTR, Variable Number of Tandem Repeat). У каждого человека клетки крови и различных тканей (костей, слюны, кожи, зубов, спермы и т. д.) содержат абсолютно одинаковую ДНК, которая остается постоянной на протяжении всей жизни, не подвергаясь изменениям. При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) по исходной матрице ДНК происходит высокоспецифичная амплификация аллелей исследуемых локусов. Электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов ДНК позволяет идентифицировать аллели полиморфных локусов (рис. 7).

Рис. 7. Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР: (1) – отец, (2) – ребенок, (3) – мать. Ребенок унаследовал некоторые генетические особенности родителей.

Только результат анализа ДНК позволяет окончательно дать заключение о достоверности отцовства. Точность данного метода определяется характером и количеством анализируемых полиморфных локусов.

Персонализированная медицина

Известно, что большинство лекарств действуют не на всех пациентов, для которых они предназначены, а лишь на 30–70 % от их числа. Кроме того, многие лекарства оказываются токсичными или аллергенными для части пациентов. Причины этого – отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Персонализация применения лекарственных средств на основе генетических исследований является наиболее перспективным направлением в молекулярной биологии. В будущем индивидуальную генетическую информацию будут использовать при подборе оптимальных профилактических мер и методов лечения и принятии других важных решений, касающихся состояния здоровья человека.

Изучением влияния генетических особенностей на развитие фармакологического ответа у пациентов при применении тех или иных лекарственных средств занимается раздел клинической фармакологии, называемый клинической фармакогенетикой.

Клиническая фармакогенетика активно развивается и уже вплотную подошла к внедрению в реальную клиническую практику, в т. ч. в России.

В США одобрено для применения несколько фармакогенетических тестов:

1.  Выявление аллелей генов CYP2D6 и CYP2C19 для выбора антидепрессантов и нейролептиков, а также их доз.

2.  Выявление аллелей гена CYP2D6 для выбора дозы атомоксетина у детей с синдромом дефицита внимания.

3.  Выявление аллелей TPMT для выбора дозы 6-меркаптопутрина у детей с лейкозами.

4.  Определение экспрессии гена HER2 для выбора трастузумаба (херцептина) у женщин с раком молочной железы.

5.  Выявление полиморфизмов гена CYP2C9 для выбора дозы варфарина (одобрено в августе 2007 г.).

Ряд компаний занимается разработкой препаратов, действующих с учетом половых и расовых различий. Примером такого является аспирин, который предотвращает инфаркт миокарда исключительно у мужчин. Разрабатывается препарат для лечения рака легких, который оказывает более выраженное влияние на женщин. Существует препарат, предназначенный для лечения людей определенной расы. Препарат “BiDil” применяют для лечения сердечной недостаточности у пациентов с черным цветом кожи.

Клонирование генов

Клонирование генов используется, в частности, для исследования генов, вызывающих наследственные болезни. В результате генно-инженерных манипуляций можно получить большое количество продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать кДНК, которую затем вставляют в вектор – фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК (рис. 8).

Рис. 8. Клонирование гена с использованием плазмиды: (1) – хромосомная ДНК организма A; (2) – ПЦР; (3 ) – множество копий гена организма А;

(4) – вставка гена в плазмиду; (5) – плазмида с геном организма А;

(6) – введение плазмиды в организм В; (7) – умножение количества копий гена организма А в организме В.

Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена – РНК или белка. Таким образом, в промышленных количествах получают многие белки для использования в медицине, сельском хозяйстве и др.

Молекулярное клонирование явилось движущей силой биотехнологической революции. Применение этого метода сделало возможным идентификацию, локализацию и описание генов, создание генетических карт и секвенирование целых геномов, проведение параллелей между генами и характеристиками организма и определение молекулярных основ этих характеристик.

Примерами использования этого подхода является идентификация генов муковисцидоза, болезни Хантингтона и нейрофиброматоза и др.

В последнее время активно развиваются ДНК-технологии, которые позволяют не только определять признак, но и одновременно определять точечные мутации или полиморфизм в известных участках генома, быстро получать разнообразную информацию о геноме, экспрессии и мутациях генов, используя большое количество олигонуклеотидных проб в ДНК-чипе. Эти технологии предоставляют большую информацию исследователям и врачам, что, несомненно, важно для диагностики и лечения заболевания.

Онкология

До недавнего времени диагностика и прогноз в онкологии основывались в основном на оценке косвенных показателей, позволяющих составлять лишь наиболее общую классификацию гистологических и морфологических подтипов. Одновременный анализ экспрессии и характеристика множества генов открывает беспрецедентные возможности формирования молекулярного портрета опухоли, благодаря развитию технологии биологических микрочипов. Микрочипы представляют бесценную информацию о патогенезе заболевания, его прогрессии, восприимчивости к терапии. Получаемый при этом массив информации может стать основой для уточнения классификации опухолей, совершенствования ранней диагностики и разработки инновационных подходов к терапии рака.

Применение ПЦР в практике службы крови

Проблема вирусной безопасности препаратов донорской крови приобретает особую актуальность в связи с эпидемической ситуацией, сложившейся в отношении вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции. Вероятность вирусной контаминации многих сотен литров плазмы в результате попадания одной или нескольких доз плазмы от доноров в серонегативном периоде становится весьма значительной. Инкубационный период острого гепатита С длится от 6 до 12 и более недель. Время появления anti-HCV различно: в одних случаях – через 2–4 недель после начала гепатита, в других – через месяцы после повышения уровня аминотрансфераз. У ряда больных с самоограничивающимся течением инфекции anti-HCV никогда не появляются, возможно, вследствие низкой концентрации циркулирующих вирусных антигенов. При этом в сыворотке у них выявляется HCV РНК методом ПЦР. У больных с посттрансфузионным отсутствием РНК HCV кратковременное выявление anti-HCV непосредственно после трансфузии может быть обусловлено пассивным переносом anti-HCV от донора. Выявление HCV РНК с помощью ПЦР может подтвердить наличие виремии при отрицательных результатах исследования anti-HCV методом ИФА. HCV РНК появляется в крови гораздо раньше других маркеров, и обнаружить ее можно через несколько дней после инфицирования.

В большинстве развитых европейских стран, с 1997 года в Нидерландах и Австралии, в известной фирме «ИММУНО» введено дополнительное генотестирование всех пулов плазмы и продуктов ее переработки. Все препараты, получаемые из этой плазмы, имеют сертификат «ПЦР-качество». Генотестирование пулов плазмы и продуктов ее переработки проводится не взамен ИФА, а параллельно.

Возможность генотестирования плазмы крови на вирусы не одного донора, а минипула, в котором объединены аликвоты плазмы от нескольких десятков или сотен доноров, доказана многими крупными банками крови Европы. Такое дополнительное генотестирование серонегативной крови в минипулах значительно снижает затраты, ускоряет получение результатов и реально увеличивает вирусную безопасность донорской крови и ее компонентов.

При использовании крови и препаратов из нее для переливания новорожденным, больным СПИДом, лицам с пересаженными органами, получающим иммунодепрессивную терапию, необходим дополнительный контроль донорской крови на вирусы герпеса и цитомегалии. Наиболее эффективным методом анализа крови на присутствие этих возбудителей является метод ПЦР.