ПЦР - анализ в клинической лаборатории (стр. 1 )

ГОУ ДПО «Иркутский государственный институт совершенствования

врачей Министерства здравоохранения и социального развития РФ»

ГУЗ «Иркутский областной клинический

консультативно-диагностический центр»

Рекомендовано Учебно-методическим объединением

по медицинскому и фармацевтическому образованию

вузов России в качестве учебного пособия для системы

послевузовского профессионального образования врачей

УМО-17-28/578

08.09.09

ПЦР - анализ в

клинической лаборатории

Учебное пособие

Иркутск – 2009

УДК 616-078

ББК 53.45

П91

Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому

и фармацевтическому образованию вузов России в качестве

учебного пособия для системы послевузовского

профессионального образования врачей

Р е ц е н з е н т ы

– доктор медицинских наук, профессор;

– доктор биологических наук, профессор.

К о л л е к т и в а в т о р о в

, ,

П91

ПЦР – анализ в клинической лаборатории: учеб. пособие / [и др.]. Иркутск: РИО ИГИУВа, 2009. 88с.

В учебном пособии представлены основные сведения об одном из современных методов диагностики – полимеразной цепной реакции (ПЦР). Дано описание всех его этапов – преаналитического, аналитического и постаналитического. Подробно освещены особенности использования ПЦР для диагностических целей, интерпретации результатов применения этой методики, обсуждаются ее преимущества и недостатки в сравнении с другими методами диагностики инфекций. Предназначено для врачей клинической лабораторной диагностики и врачей других специальностей.

УДК 616-078

ББК 53.45

© ГОУ ДПО ИГИУВ Росздрава, 2009

© ГУЗ ИОККДЦ, 2009

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение.................................................................................................	6
История открытия и разработка метода ПЦР...................................	7
Механизм полимеразной цепной реакции........................................	8
Основные компоненты ПЦР................................................................	8
Праймеры........................................................................................	8
Полимераза.....................................................................................	9
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты..........................................	9
Ионы двухвалентных металлов..................................................	9
Буферы............................................................................................	9
Анализируемый образец................................................................	9
Циклический температурный режим..........................................	10
Стадии постановки ПЦР......................................................................	11
Пробоподготовка (выделение ДНК/РНК)......................................	11
Амплификация..................................................................................	13
Факторы, влияющие на эффективность амплификации.....	15
Использование «горячего старта» при постановке ПЦР....	15
Приборное обеспечение.............................................................	16
Регистрация результатов................................................................	16
Возможности лабораторной диагностики инфекционных болезней..................................................................................................	19
Микробиологический метод.................................................................	20
Иммунологический метод....................................................................	21
Микроскопия.........................................................................................	21
Генотипический метод (ПЦР)..............................................................	21
Преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики...................................................................	23
Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.............................................................................	23
Специфичность..........................................................................	23
Чувствительность......................................................................	24
Актуальность ответа (быстрота получения результата анализа) ....................................................................................	24
Возможность экспертизы..........................................................	25
Исследуемый биологический материал...........................................	25
Локализация возбудителей................................................................	26
Правила забора материала и транспортировки клинического материала для ПЦР-диагностики........................................................	26
Кровь, плазма, сыворотка..............................................................	27
Соскоб с эпителиальных клеток для выявления ДНК возбудителей инфекций, передающихся половым путем..................................	28
Факторы, влияющие на эффективность выявления урогенитальных патогенных микроорганизмов с помощью НК.....................	28
Правила подготовки больного для ПЦР-диагностики урогенитальных инфекций........................................................	29
Мазок с конъюнктивы, слизистой зева и дыхательных путей.....	30
Моча.................................................................................................	30
Мокрота............................................................................................	31
Синовиальная жидкость.................................................................	31
Другие биологические жидкости....................................................	31
Секционный материал....................................................................	31
Применение метода ПЦР в медицине..................................................	31
Диагностическое значение ПЦР-исследований в клинике инфекционных заболеваний..............................................................	31
Гепатит А (HАV), Е (HЕV) .............................................................	34
Гепатит В (HВV) ............................................................................	34
Гепатит D (ВГD) ............................................................................	35
Гепатит С (HCV) ...........................................................................	36
Использование ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии.......................	38
Применение ПЦР в урогинекологической практике.........................	39
Основные клинические синдромы и урогенитальные инфекции	40
Криминология...................................................................................	44
Установление отцовства....................................................................	45
Персонализированная медицина......................................................	46
Клонирование генов...........................................................................	47
Онкология............................................................................................	48
Применение ПЦР в практике службы крови.....................................	48
Управление качеством ПЦР-исследований......................................	49
Документы, регламентирующие использование методов генодиагностики инфекций.................................................................................	49
Основные принципы организации ПЦР-лабораторий.......................	50
Порядок проведения работ в лаборатории........................................	51
Обеспечение качества в ходе ПЦР-исследований............................	53
Преаналитический этап..................................................................	54
Аналитический этап........................................................................	56
Контроль качества ПЦР-исследований...................................	57
Контроль реакции амплификации.......................................	59
Внутренний контроль ВКО...................................................	60
Проблема контаминации...........................................................	60
Действия при возникновении контаминации нуклеиновыми кислотами.................................................	62
Постаналитический этап......................................................................	63
Заключение.............................................................................................	67
Вопросы для самопроверки................................................................	67
Ответы на вопросы для самопроверки...............................................	71
Список литературы................................................................................	72
Приложение.............................................................................................	73
Возможности ПЦР-диагностики в ГУЗ ИОККДЦ...............................	73
Комплекс исследований на заболевания, передающиеся половым путем (ЗППП), 2Ж3001.................................................	73
Хламидиоз, 2Ж3002......................................................................	73
Туберкулез, 2ЖЗ003.....................................................................	74
Гепатит С, 2Ж3004........................................................................	75
Микоплазма гоминис, 2Ж3005.....................................................	76
Трихомониаз, 2Ж3006...................................................................	76
Гепатит В, 2Ж3007........................................................................	77
Уреаплазма, 2Ж3009....................................................................	77
Папиллома (ВПЧ с определением онкогенности), 2Ж3010.......	78
Гонорея, 2Ж3011...........................................................................	79
Гепатит С количественный, 2Ж3012...........................................	80
Генотипирование вируса гепатита С, 2Ж3013...........................	80
Микоплазма гениталиум, 2Ж3015................................................	81
ЦМВ, 2Ж3019.................................................................................	82
Вирус Эпштейна-Барр, 2Ж3020...................................................	83
Вирус герпеса I-го и II-го типов, 2Ж3021.....................................	84
Вирус герпеса 6-го типа, 2Ж3022................................................	85
Токсоплазмы гондии, 2Ж3023......................................................	85
Энтеровирус, 2Ж3027...................................................................	86
Гепатит В количественный, 2Ж3031............................................	87

ВВЕДЕНИЕ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой фрагмент ДНК, содержащий специфическую генетическую информацию любого организма среди огромного количества другой ДНК и многократно размножить искомый фрагмент в случае, если он действительно присутствует в исследуемом материале. При ПЦР-диагностике размножению подвергается не бактерия, а только ее ДНК, причем не вся молекула ДНК, а только строго специфическая нуклеотидная последовательность, имеющаяся лишь у данного возбудителя.

В начале 70-х годов норвежским ученым К. Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории Нобелевского лауреата Х.-Г. Кораны (Har Gobind Khorana) впервые были описаны основные принципы амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК-синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной, так как ёще не была продемонстрирована основная черта ПЦР - экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 г. К. Мюллисом (Kary Mullis). За разработку ПЦР-метода он был удостоен Нобелевской премии в области химии в 1993 г.

Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 30 лет и позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень. За короткое время ПЦР-анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического клинического использования. Этот метод нашел применение в:

l  диагностике инфекционных заболеваний, в том числе вызванных агентами, трудно поддающимися культивированию:

l  в клинической диагностике вирусных и бактериальных инфекций; диагностике наследственных (муковисцидоз, фенилкетонурия, гемофилия), онкологических и др. заболеваний;

l  HLA–типировании;

l  гражданской (определение родства) и судебной медицине (идентификация личности);

l  генотипировании микроорганизмов, оценке их вирулентности;

l  определении устойчивости микрофлоры к антибиотикам;

l  пренатальной диагностике;

l  биологическом контроле препаратов крови.

Кроме того, молекулярные методы используются в таких областях, как эпидемиология, фармакология, экология, сельское хозяйство, пищевая промышленность, биотехнология.

Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую популярность.

ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ И РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПЦР

Молекулярная биология началась с эры ДНК. ДНК была провозглашена "главной молекулой жизни", "нитью жизни", началом начал и основой всего живого. Белки, ранее рассматриваемые как основной компонент живых систем, теперь "увольнялись" со всех руководящих позиций и "назначались" на второстепенные роли катализаторов, обслуживающих существование ДНК. Роль другого типа нуклеиновых кислот - РНК - сводилась к функции посредников, производимых на матрицах ДНК и направляющих синтез белков. Схема "ДНК—>РНК —> белок" с необратимостью процессов передачи информации, обозначаемых стрелками, получила название "центральной догмы молекулярной биологии".

Появление ПЦР было обусловлено определенными достижениями молекулярной генетики. В 1953 г. Френсис Крик и Джеймс Уотсон открыли структуру двойной спирали ДНК. Эта их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией. Еще одной предпосылкой к появлению нового метода явилась расшифровка нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. ПЦР стала действительно недорогой и технологичной методикой в результате использования ДНК-полимеразы, выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus, обитающей в трубопроводах горячей воды. Особенность этой полимеразы заключается в ее исключительной термостойкости, она выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а также в высокой рабочей температуре этого фермента (оптимум работы +72 °С).

Универсальным носителем генетической информации и наследственных признаков у всех существующих на Земле организмов является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Исключение составляют только некоторые микроорганизмы, например, вирусы, носителем генетической информации у которых является РНК – одноцепочечная рибонуклеиновая кислота. Хотя по своему химическому строению РНК несколько отличается от ДНК, она, тем не менее, выполняет у этих вирусов роль, аналогичную роли ДНК (табл. 1).

ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из последовательности химически связанных нуклеотидов. Каждый нуклеотид (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ и дУТФ в РНК) содержит гетероциклическое кольцо из атомов углерода и азота (азотистое основание), пятиуглеродное сахарное кольцо (пентозу) и фосфатную группу. Две полинуклеотидные цепи в ДНК соединяются двумя или тремя водородными связями, возникающими между азотистыми основаниями.

Таблица 1

Основные различия между ДНК и РНК

ДНК	РНК
Хранение генетической информации	Передача генетической информации
Стабильный компонент клетки	Нестабильный короткоживущий компонент клетки
Содержит генетическую информацию	Участвует в синтезе белка

В основу модели ДНК легли ее свойства: