Производили взятие крови для проведения морфологических, биохимических и иммунологических исследований, включая показатели эндогенной интоксикации, перед лечением и после клинического выздоровления по группам комплексной терапии по 5 животных. Кровь брали от одних и тех животных. Микробиологические исследования проводили перед лечением и после клинического выздоровления из группы комплексной терапии (по 5 проб из каждой группы, всего 40 проб) на наличие возбудителей и их чувствительность к компонентам препаратов: перекрестно для всех четырех. В матке гистологически изучали общую структурную организацию эндометрия (10% формалин) до и после лечения (ещё при незакрытой шейке матки) от каждой группы (где один препарат) и из группы комплексной терапии (по 3 животных из каждой группы, всего 42 пробы).

С целью характеристики общего состояния животных при проведении опытов были взяты пробы крови для проведения гематологических, биохимических и иммунологических исследований. Общее состояние животных оценивали общепринятыми методами (, , 1982; с соавт., 2004). Морфологический анализ крови проводили на гематологическом анализаторе «АВХ Micros 60», биохимические исследования – на анализаторе «Hitachi-902» в соответствии с «Методическими рекомендациями по применению биохимических методов исследований крови животных» (2005). Фракции белка определяли электрофорезом в агарозном геле, концентрацию общего белка и липидов наборами фирмы «Витал» (Санкт-Петербург).

Для характеристики неспецифической иммунологической резистентности организма определяли показатели гуморального звена: бактерицидную активность (%) сыворотки крови; лизоцимную (мкг/мл) активность сыворотки крови и клеточного звена: фагоцитарную активность лейкоцитов в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке и коррекции неспецифической резистентности животных» (2005).

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Для морфологических исследований материал был взят от 7 коров, убитых после окончания лечения препаратами диометр, тетраметр и энроцид.

Кроме того, в динамике развития послеродового эндометрита у коров, материал отбирался методом биопсии (патент РФ, № 000).

Материал для световой микроскопии фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и жидкости Карнуа, обезвоживали в спиртах, хлороформе, заливали в парафин, готовили срезы на микротоме МПС-2 толщиной 5-7 мкм, депарафинировали и окрашивали гематоксилин-эозином, по Ван-Гизон и толлуидиновым синим.

Фиксацию материала для электронной микроскопии проводили в 2,5% - ном растворе глютарового альдегида на 0,114 М коллидиновом буфере (рН – 7,3) на холоде с постфиксацией в 1% - растворе тетраокиси осмия на том же буфере. Для достижения осмиомолярности 360 мосм во второй фиксатор вводили 0,05 М железосинеродистого калия и раствор Рингера. Материал заключали в смолу Эпон – 812. готовились полутонкие срезы, окрашенные азур-2 в сочетании с фуксином основным, которые просматривались в световом микроскопе «Leica». Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме Ultracut «Leica», монтировали на вольфрамовые сетки, контрастировали цитратом свинца и уранилацетатом и просматривали в электронном микроскопе ЕМ-208 фирмы Philips ( 1974; , 1963; Reynolds Е. S., 1963).

Статистическая обработка полученных данных проведена методами математической статистики, принятыми в биологии и медицине (, 1973; ,1978), а также с использованием прикладных программ «Statistica 5.0» и «Microsoft Excel» на РС «Pentium III».

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Этиологическая структура послеродового эндометрита у коров

в хозяйствах ЦЧР

Забоеваемость коров послеродовыми эндометритами учитывалась в хозяйствах Белгородской (», , колхоз им. Фрунзе), Липецкой ( Добровского района, «Дружба» Грязинского района) и Воронежской (, , Павловского района) областей.

Нами было установлено, что заболевание коров послеродовым эндометритом зависит от количества животных в хозяйстве. Больше всего коров заболевает в хозяйствах с более высокой концентрацией поголовья (табл. 4).

Таблица 4

Распространение эндометритов у коров в хозяйствах ЦЧР

Кол-во коров в

хозяйстве (гол.)

Кол-во заболевших эндометритом

коров

%

Воронежская область

500

140

28,0

420

92

21,9

1100

517

47,0

Белгородская область

»

620

321

51,8

615

291

47,3

Колхоз им. Фрунзе

2500

1520

60,8

Липецкая область

261

55

21,0

«Дружба»

700

483

69,0

При лабораторном исследовании влагалищной слизи были выделены культуры Escherichia coli, citrobacter spp, Staphylococcus aureus, Staphylococcus albus, Streptococcus spp, Proteus vulgaris. Выделенная микрофлора была чувствительна к антибиотикам: норфлоксацин, энрофлоксацин, гентамицин, неомицин, левомицетин, канамицин, доксициклин, тетрациклины, фурагин, фуразолидон.

Таким образом, заболеваемость коров острым послеродовым эндометритом колебалась в пределах от 21 до 69% и, чем больше количество коров в хозяйстве, тем больше вероятность их заболеваемости острым послеродовым эндометритом.

3.2. Клинико-морфологическая, гистоструктурная и электронномикроскопическая характеристика острого послеродового эндометрита у коров

Клиническое состояние коров, больных острым послеродовым эндометритом, в большинстве случаев, находилось в пределах нормы, а у некоторых из них наблюдалось лёгкое угнетение и небольшое снижение молочной продуктивности.

У больных коров регистрировали выделение из матки гнойно-слизистого экссудата полужидкой консистенции с желтоватым или буроватым оттенком. Экссудат отмечался на корне хвоста и в нижнем углу вульвы в виде засохших корочек. Клиническое проявление острого послеродового эндометрита у коров характеризовалось наличием катаральных выделений из матки. Катаральный экссудат выделялся при дефекации, мочеиспускании и, как правило, после ночного отдыха коров. На внутренней поверхности хвоста и седалищных буграх коровы экссудат обнаруживался в виде корочек.

У коров, больных гнойно-катаральным эндометритом, иногда наблюдались слизисто-гнойные истечения из матки серо-желтого цвета.

Установлено, что гематологические, биохимические и иммунологические показатели крови коров, больных острым послеродовым эндометритом, имеют отклонения от нормы, а иммунный статус организма был понижен (табл. 5).

Таблица 5

Гематологические и иммунологические показатели крови коров

при остром послеродовом эндометрите

Показатели

Клинически

здоровые

Больные

на 10-15 дни после отела

Эритроциты, 1012/л

6,48±0,58

6,25±0,41

Лейкоциты, 109/л

6,84±0,32

9,90±0,52

Общий белок, г/л

81,5±7,54

76,8±4,69

γ-глобулины, %

30,6±1,72

26,8±1,15

Общие иммуноглобулины (г/л)

28,1±4,37

25,8±0,98

ЛАСК, мкг/мл

0,36±0,04

0,25±0,03

БАСК, %

68,9±5,66

59,1±4,35

Нейтрофилы, %

29,2±2,11

32,6±2,71

Эозинофилы, %

7,20±0,78

5,40±2,62

Моноциты, %

4,20±0,41

5,17±1,07

Лимфоциты, %

62,9± 1,82

57,9±3,90

Структурные изменения при остром послеродовом эндометрите у коров характеризовались следующим образом: Макроскопические. Наблюдалась гиперемия и отёчность слизистой оболочки преддверия влагалища и влагалища, наличие ссадин, точечных и полосчатых кровоизлияний. В просвете влагалища имелся гнойно-слизистый экссудат, выделяющейся из канала шейки матки. Канал шейки матки, как правило, был открытым. Складки влагалищной части шейки матки выглядели набухшими, отёчными и покрасневшими, присутствовали точечные и полосчатые кровоизлияния.

При вскрытии коров, убитых на 10-15 дни после отёла, инволюция матки была не завершена. Ее величина (1925±35 см2) соответствовала 3,5-4,5 месячной беременности. На слизистой оболочке матки был виден обильный катаральный экссудат, который заполнял складки слизистой оболочки, а также наблюдали его скопление вокруг и вблизи карункулов. На фоне слизисто-катарального налета на слизистой оболочке имелись множественные кровоизлияния, которые диффузно охватывали всю внутреннюю поверхность органа. Они были, в большинстве своем, точечные и пятнистые. Вся слизистая оболочка матки была набухшей и отечной (Рис. 1).

Рис. 1. Макроскопические изменения при остром послеродовом эндометрите у коров: а) Обильное слизисто-гнойное выделение из матки; б) Точечно-полосчатые кровоизлияния в области складок шейки матки; в) Задержка инволюции матки; г) Катаральный налет и точечно-пятнистые кровоизлияния на слизистой оболочки эндометрия. Оригиналы.

Гистологические. В слизистой оболочке матки наблюдалось нарушение целостности покровного эпителия, его некроз и десквамация, а местами отмечалось полное отсутствие эпителиальной выстилки.

В структурной организации функционального слоя слизистой оболочки матки наблюдалось обилие клеток крови на фоне лимфоидных и эпителиальных скоплений. Эти экссудативно-инфильтративные процессы охватывали всю толщину эндометрия и характеризовали ее отечность. Поэтому эндометрий выглядел набухшим и был обильно инфильтрирован эмигрировавшими клетками.

В толще эндометрия маточные железы, как правило, были воспалены, отечны и содержали набухший эпителий. Они находились в окружении воспалительных инфильтратов. В слизистой оболочки матки отмечался отёк и диффузная клеточная инфильтрация. В слизистой оболочке матки регистрировалась обильная инфильтрация лейкоцитов, гистиоцитов, лимфоцитов.

В структурной организации эндометрия на полутонких срезах регистрировали острые гнойно-катаральные процессы. Верхний слой эндометрия превращался в клеточный детрит с воспалительным инфильтратом. Здесь же накапливался обильный катаральный экссудат, содержащий как клеточный детрит, так и форменные элементы крови и диффузно расположенные микробные клетки.

В сосудистом слое отмечали набухание эндотелия сосудов, а их просветы частично уменьшались и содержали единичные форменные элементы крови. В глубоких слоях эндометрия маточные железы в большинстве своем находились в состоянии некробиоза, а в уцелевших железах регистрировали выраженную дистрофию клеток.

Таким образом, выявленные в полутонких срезах изменения в эндометрии были характерны острому гнойно-катаральному эндометриту (Рис. 2).

Рис. 2. Гистологические изменения в эндометрии при остром послеродовом эндометрите у коров: а) Катаральная слизь с форменными элементами крови и бактериями на слизистой оболочки эндометрия; б) Набухание и некробиоз эпителиального пласта эндометрия; в) Дистрофия и некробиоз эпителиальных и лимфоидных клеток и отечность стромы функционального слоя эндометрия; г) Некробиотическое состояние маточных желез эндометрия. Окр. Азур 2 в сочетании с фуксином основным. Ув. 200 (б), 400 (в, г), 800 (а).

Ультраструктурные. Выявленные гистологические структурные изменения в матке у коров при эндометрите были подтверждены ультраструктурной организацией клеток слизистой оболочки эндометрия.

На апикальной части эпителия, уцелевших на поверхности слизистой оболочки эндометрия, отмечалось разрушение микроворсинок и накопление катаральной слизи с микрофлорой, что указывало на структурные нарушения клеток эндометрия. Далее апикальная часть эпителия полностью разрушалась, теряла микроворсинки, вакуолизировалась и превращалась в гомогенную массу.

В катаральной слизи на поверхности эндометрия наблюдалось обилие бактериальной флоры, в которой превалировали диплококки. Местами отмечалось разрушение бактериальной флоры и появление макрофагов – гистиоцитов. Хотя единичные бактерии встречались на фоне множественных просветленных митохондрий в эпителиальном пласте и в глубоких слоях эндометрия. В большинстве случаев преобладали некротические (апоптические) процессы. В эндометрии значительно изменялась микроциркуляция в паренхиме органа. При этом регистрировалось резкое набухание эндотелия сосудов и кровеносных капилляров.

В целом, в ультраструктурной организацьии эндометрия у коров, больных острым послеродовым эндометритом, наблюдались глубокие дистрофические и некробиотические процессы в клетках паренхимы и стромы эндометрия, а также экссудативные процессы с изменением целостности микроциркуляторного русла (Рис. 3).

Рис. 3. Ультраструктурные изменения клеток эндометрия при остром послеродовом эндометрите у коров: а) Разрушение микроворсинок на апикальной поверхности эпителия; б) Обилие кокковой микрофлоры на поверхности эпителия; в) Некробиоз клеток эпителия; г) Парциальный отек ядра и цитоплазмы гистиоцита. Ув. 2800 (в, г), 3500 (а), 5600 (б).

3.3. Разработка новых лекарственных препаратов для лечения больных эндометритом коров, их фармако-токсикологическая и клиническая

оценка

3.3.1. Обоснование создания новых комплексных антибактериальных препаратов для лечения эндометрита у коров

Исследования по разработке новых антимикробных препаратов для лечения эндометрита у коров проведены в два этапа. На первом этапе определен видовой состав микрофлоры половых путей 96 больных послеродовым эндометритом коров из сельхозпредприятий Воронежской, Липецкой и Белгородской областей.

Установлено, что микрофлора половых путей коров, больных эндометритом, представлена, в основном, ассоциациями грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (77,1%), а также микроскопическими грибами.

Из общего числа изолированных культур на долю Е. coli приходилось 43,2%; Ent. faecalis – 19,6%, Ent. faecium – 18,5%; Citrobacter diversus – 15,6%; Proteus vulgaris – 3,1%.

Чувствительность микрофлоры от больных коров в различных хозяйствах имела отличия. Исследования показали, что выделенная микрофлора была чувствительной к норфлоксацину – в 74,5% случаев, к энрофлоксацину и неомицину – в 78%, к левомицетину – в 67%, к канамицину, доксициклину и тетрациклину – в 57,8%, к фурагину – в 34,8%, к фуразолидону – в 24,2%. К бензилпинициллину, ампициллину, эритромицину, рифампицину чувствительными было менее 10% от числа выделенных культур. В 38,9% случаев микрофлора обладала множественной лекарственной устойчивостью.

Это явилось основанием для разработки новых антибактериальных препаратов для лечения и профилактики послеродовых заболеваний у коров. Исходя из данных литературы, фармакологической и фармацевтической совместимости, возможного эффекта синергизма были разработаны следующие составы препаратов: 1 – диоксидин : канамицин: ДМСО, 2 – диоксидин : окситетрациклин : ДМСО и 3 – энрофлоксацин : ДМСО.

На втором этапе было проведено изучение антимикробной активности препаратов и их компонентов (диоксидин и канамицин; диоксидин и окситетрациклин; энрофлоксацин). Для выявления оптимального соотношения компонентов в препаратах антимикробную активность различных комбинаций сравнивали с активностью исходных действующих веществ.

Как следует из представленных данных на рисунке 4, минимальная бактериостатическая концентрация диоксидина в отношении Staph. аureus 209 Р составила 15,6 мкг/мл и E. coli 866 – 3,9 мкг/мл, а канамицина соответственно – 0,78 и 3,9 мкг/мл. Наиболее выраженным антимикробным действием обладала четвертая композиция, минимальная бактериостатическая концентрация которой в отношении Staph. аureus снизилась в 40 раз, в отношении E. coli 866 – в 2,5 раза по сравнению с таковой у диоксидина, а по сравнению с канамицином - в 2 раза в отношении Staph. аureus и в 2,5 раза в отношении E. coli 866.

Рис. 4. Антимикробная активность диоксидина, канамицина и различных композиций

Таким образом, совместное применение диоксидина и канамицина в различных соотношениях позволило снизить минимальную бактериостатическую концентрацию препарата в отношении изученных культур, что свидетельствует о синергидном действии составляющих компонентов. Но наиболее эффект синергизма проявился в композиции 4 (К4). Так антимикробная активность диоксидина в отношении стафилококков возросла в 120 раз, в отношении эшерихий - в 7,5 раза. Антимикробная активность канамицина в отношении эшерихий возросла в 3,8 раза, стафилококков - возросла в 3 раза.

В связи с этим в дальнейшей работе из изученных композиций была выбрана композиция 4, которая была названа – диометр.

На рисунке 5 представлены результаты изучения антимикробной активности различных комбинаций в сравнении с диоксидином и окситетрациклином. Как следует из представленных данных, минимальная бактериостатическая концентрация диоксидина в отношении Staph. аureus 209 Р составила 15,6 мкг/мл и E. coli 866 – 3,9 мкг/мл, а окситетрациклина соответственно – 3,9 и 12,5 мкг/мл. Наиболее выраженным антимикробным действием обладала четвертая композиция, минимальная бактериостатическая концентрация которой в отношении Staph. аureus снизилась в 40 раз, в отношении E. coli 866 - в 1,25 раза по сравнению с таковой у диоксидина. По сравнению с окситетрациклином минимальная бактериостатическая концентрация снизилась в 10 раз в отношении Staph. аureus и в 4 раза в отношении E. coli 866.

Таким образом, совместное применение диоксидина и окситетрациклина в различных соотношениях позволило снизить минимальную бактериостатическую концентрацию препарата в отношении изученных культур, что свидетельствует о синергидном действии составляющих компонентов.

Но наиболее эффект синергизма проявился в композиции 4 (К4). Так антимикробная активность диоксидина в отношении стафилококков возросла в 120 раз, в отношении эшерихий - в 3,8 раза. Антимикробная активность окситетрациклина в отношении эшерихий возросла в 6 раз, стафилококков - возросла в 15 раз.

В связи с этим в дальнейшей работе из изученных композиций была выбрана композиция 4, которая была названа – тетраметр.

Обоснованность данных композиций обусловлена тем, что в лекарственной форме соче-

Рис.5. Антимикробная активность диоксидина, окситетрациклина и различных композиций

таются по два антимикробных компонента с различным спектром и механизмом антимикробного действия, что в свою очередь обеспечивает синергидный эффект.

Исходя из данных, полученных в опытах in vitro, энрофлоксацин показал наиболее высокую минимальную бактериостатическую концентрацию в отношении Staph. аureus 209 Р и E. coli 866 составила 0,39 мкг/мл. Антимикробная активность диоксидина в отношении Staph. аureus 209 Р была ниже в 15 раз, у канамицина – в 2 раза и у окситетрациклина – в 10 раз. В отношении E. coli 866 у диоксидина и канамицина в сравнении с энрофлоксацином антимикробная активность была ниже в 10 раз, у окситетрациклина – в 32 раза. Также в ходе экспериментов было установлено, что лекарственная форма комплексных препаратов на основе энрофлоксацина и канамицина или окситетрациклина нестабильны. Поэтому обоснованность состава препарата энроцид обусловлена высокой антимикробной активностью энрофлоксацина и достаточно ограниченной фармацевтической совместимостью его с канамицином и окситетрациклином.

3.3.2. Фармакотоксикология диометра

3.3.2.1. Антимикробная активность диометра

При изучении антимикробной активности диометра установлено, что препарат обладает широким спектром антимикробного действия.

Наиболее выраженное действие он проявлял в отношении кокковой микрофлоры: стрептококков и стафилококков – 0,39–1,56 мкг/мл. Активность препарата в отношении музейных штаммов эшерихий была на уровне – 1,56 мкг/мл, однако, в отношении полевых она была ниже в 2 раза (3,12 мкг/мл). Бактерицидное действие препарата в отношении изученных культур превышало бактериостатическое соответственно в 2 раза.

3.3.2.2. Острая токсичность диометра

В результате изучения острой токсичности препарата диометр на лабораторных животных было установлено, что препарат в соответствии с классификацией (для парентерального введения) относятся к относительно безвредным препаратам (табл. 6).

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6