На правах рукописи
ШАПОШНИКОВ Иван Тихонович
ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЯ КОМПОЗИЦИОННЫХ
АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ИХ КЛИНИЧЕСКАЯ
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ ПОСЛЕРОДОВОМ ЭНДОМЕТРИТЕ У КОРОВ
06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией
06.02.06 – ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора ветеринарных наук
Воронеж - 2013
Работа выполнена в отделе фармакологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии
Научные консультанты: | доктор биологических наук
|
Официальные оппоненты: | Аргунов Муаед Нурдинович |
доктор ветеринарных наук, профессор, профессор кафедры терапии и фармакологии факультета ветеринарной медицины и технологии животноводства ФГБОУ ВПО Воронежский аграрный университет им. императора Петра I | |
| |
доктор ветеринарных наук, заместитель директора Липецкого филиала ОГБУ Тульская межобластная ветеринарная лаборатория | |
доктор ветеринарных наук, профессор, профессор кафедры зоотехнии и основ ветеринарии ФГБОУ ВПО Мичуринский государственный аграрный университет | |
Ведущая организация: | ФГОУ ВПО Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. |
Защита состоится « 16 » августа 2013 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 006.004.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии (ВНИВИПФиТ) 14-б.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии
Автореферат разослан « » июля 2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета, к. б.н., доцент
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из причин возникновения временного или постоянного бесплодия у коров являются послеродовые эндометриты, сдерживающие воспроизводство стада крупного рогатого скота. Поэтому вопросам этиологии, патогенеза, профилактики послеродовых эндометритов, совершенствованию способов лечения больных коров уделяется большое внимание.
Однако, несмотря на достижения современной ветеринарной науки в этой области, послеродовые эндометриты повсеместно распространены, носят массовый характер и остаются одной из главных проблем в воспроизводстве животных.
с соавт. (2005), , (2009), с соавт.(2009, 2012), (2012) и др. считают, что болезни органов размножения у крупного рогатого скота представляют одну из важнейших проблем современного ветеринарного акушерства и гинекологии, так как являются основной причиной возникновения у коров длительного бесплодия, сопровождающегося снижением молочной продуктивности, прекращением лактации и преждевременной их выбраковкой. Болезни органов размножения развиваются на фоне глубоких структурных изменений в половых органах. В матке они проявляются в виде отечности серозной и мышечной оболочек, отсутствия признаков ретракции, диффузной инфильтрации эндометрия лимфоидными клеточными элементами, некроза, распада и отторжения поверхностного слоя, сильной секуляризации и кровенаполнения кровеносных сосудов, вследствие чего в матке образуется кровоточащая раневая поверхность, приводящая к обильным кровянистым выделениям из половых органов. При этом создаются благоприятные условия для проникновения в полость матки и размножения патогенных микроорганизмов, токсины которых усиливают нарушение обмена веществ и микроциркуляцию в пораженных тканях. Устанавливается порочный круг патологических процессов с изменением причинно-следственных отношений. В развитии патологического процесса значительно возрастает роль условно-патогенной микрофлоры, в связи с повышением ее вирулентности и числа штаммов, устойчивых к лекарственным препаратам, а также с высокой частотой инфицирования беременных животных.
Поэтому одной из причин недостаточно эффективной терапии коров и риска увеличения послеродовых осложнений является возрастающая лекарственная устойчивость возбудителей заболевания. В этой связи необходим постоянный мониторинг как за составом микроорганизмов-возбудителей, так и за динамикой развития их резистентности. Это позволяет разработать адекватную стратегию и тактику антибактериальной терапии в конкретных условиях каждого молочного комплекса или фермы с включением в лечебный курс препаратов широкого спектра действия ( с соавт., 2005; с соавт., 2009).
Исходя из этого, в системе лечебно-профилактических мероприятий при болезнях органов размножения важная роль принадлежит их фармакотерапии и фармакопрофилактике ( с соавт., 2005).
В настоящее время для профилактики и лечения эндометритов применяется большое количество фармакологических средств, имеющих различный механизм действия. Среди них перспективными являются комплексные антимикробные препараты.
Однако, при большом количестве предлагаемых препаратов для лечения больных эндометритами коров, недостаточное внимание уделяется их влиянию на последующую воспроизводительную функцию животных и экологическую чистоту, получаемых от них продуктов.
По данным литературы возникновение, развитие и исход воспалительных процессов в эндометрии у коров в значительной степени определяется состоянием естественной резистентности организма, и в частности местной защиты матки. При этом уровень местной защиты любого органа неразрывно связан с уровнем его структурной организации, что не всегда учитывается при изучении патогенеза эндометритов и испытании лечебно-профилактических средств (, 2006; , 2005).
В связи с этим многие предложенные препараты для лечения больных эндометритом коров, без учета их влияния на структурную организацию матки и организма животного, часто не обеспечивают получения желаемого результата.
Поэтому разработка как более эффективных методов и средств, так и комплексных препаратов для лечения больных эндометритом коров, должна проводиться с учетом местной защитной реакции матки, которая находится в прямой зависимости от состояния ее структурной организации и всего организма.
Однако до настоящего времени недостаточно изучены композиционные препараты при эндометритах у коров, а также их влияние на морфофункциональное состояние органов размножения у больных эндометритом коров.
Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение распространения, патогенеза и патологической морфологии острых послеродовых эндометритов у коров, разработка, изучение экспериментальной и клинической фармакологии новых композиционных препаратов для терапии и профилактики острых послеродовых эндометритов у коров с учетом их влияния на морфофункциональное состояние эндометрия.
Задачи исследования:
1. Изучить распространение и этиологическую структуру послеродовых эндометритов у коров в хозяйствах ЦЧР;
2. Дать клинико-морфологические и гисто-структурную характеристику матки коров при развитии в ней воспалительного процесса;
3. Разработать новые композиционные антибактериальные препараты для лечения коров с воспалительными заболеваниями матки и провести их фармако-токсикологическую оценку;
4. Выявить влияние новых композиционных препаратов на иммунобиохимический статус коров и структурную организацию эндометрия;
5. Провести клинические испытания и определить эффективность применения новых композиционных антибактериальных препаратов в комплексной терапии коров при послеродовом эндометрите;
6. Установить возможность применения новых антибактериальных препаратов для профилактики послеродовых заболеваний у коров;
7. Разработать и утвердить нормативно-техническую документацию и инструкции по применению на новые комплексные антибактериальные препараты для профилактики и лечения послеродовых эндометритов у коров.
Научная новизна. Определена этиологическая структура и дана клинико-морфологическая, гистологическая и ультраструктурная оценка тканей матки у коров после родов. Расширены представления о механизмах развития острого послеродового эндометрита у коров. Научно обоснованы состав и рецептура новых высокоэффективных комплексных антибактериальных препаратов диометр, тетраметр и энроцид для лечения и профилактики послеродового эндометрита у коров. Проведена их фармако-токсикологическая оценка. Выяснено их действие на организм коров на морфобиохимическом уровне и на матку - на тканевом, клеточном и субклеточном уровне организации эндометрия. Научно аргументирована, экспериментально и клинически доказана перспективность использования новых комплексных антибактериальных препаратов диометр, тетраметр и энроцид в ветеринарной практике.
Новизна исследований подтверждена патентами РФ на изобретение № 000 и № 000.
Практическая значимость и внедрение. На основании результатов исследований разработаны новые эффективные антибактериальные препараты диометр, тетраметр и энроцид для профилактики и лечения больных эндометритом коров и налажено их серийное производство.
Материалы исследований вошли в «Методическое пособие по профилактике бесплодия у высокопродуктивного молочного скота», одобренное секцией патологии, фармакологии и терапии Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Воронеж, 2010) и «Практическое руководство по обеспечению продуктивного здоровья крупного рогатого скота», допущенное учебно-методическим объединением в области зоотехнии и ветнадзора в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений (УМО № от 01.01.2001 г.).
В Российской Федерации Россельхознадзором проведена регистрация препаратов диометр (регистрационный номер ПВР-2-0.3/01214), тетраметр (регистрационный номер ПВР-2-0.3/01216) и энроцид (регистрационный номер ПВР-2-0.3/01215) и утверждены инструкции по их применению.
Апробация. Основные положения и результаты исследования представлены, доложены и одобрены на: годовых отчетах по НИР Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии (Воронеж, ); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней обмена веществ у сельскохозяйственных животных в современных условиях», посвященной 40-летию ГНУ ВНИВИПФиТ (Воронеж, 2010); 3-м съезде фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» (Санкт-Петербург, 2011); 17-ой Всероссийской научно-методической конференции по патологической анатомии животных «Современные проблемы патологической анатомии, патогенеза и диагностики болезней животных» (Москва, 2011); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию Краснодарского НИВИ (Краснодар, 2011); Международной научно-технической конференции «Биотехнологические системы в производстве пищевого сырья и продуктов: инновационный потенциал и перспективы развития» (Воронеж, 2011); Международной научно-практической конференции «Экологические проблемы использования природных и биологических ресурсов в сельском хозяйстве» (Екатеринбург, 2012); Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию со дня рождения профессора и 50-летию создания Воронежской школы ветеринарных акушеров «Современные проблемы ветеринарного акушерства и биотехнологии воспроизведения животных» (Воронеж, 2012); IV съезде фармакологов и токсикологов России «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» (Москва, 2013).
Публикации. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 38 печатных работах, в том числе 14 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Ветеринария», «Актуальные вопросы ветеринарной патологии», «Ветеринарная патология», «Ветеринарный врач», «Международный вестник ветеринарии»), 3 методических пособиях, 3 патентах.
Основные положения, выносимые на защиту:
Ø распространение, клинико-морфологическая и патоморфологическая характеристика острого послеродового эндометрита у коров в хозяйствах ЦЧР;
Ø обоснование состава и рецептуры новых композиционных препаратов - диометр, тетраметр и энроцид
Ø фармако-токсикология новых композиционных препаратов диометр, тетраметр и энроцид;
Ø обоснование применения новых композиционных препаратов диометр, тетраметр и энроцид при остром послеродовом эндометрите с учетом их влияния на структурную организацию эндометрия у коров;
Ø клиническая фармакология диометра, тетраметра и энроцида при терапии и профилактике острого послеродового эндометрита у коров.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 318 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, предложений, списка литературы, который включает 396 источников, в том числе 76 зарубежных. Работа иллюстрирована 60 рисунками и 89 таблицами.
3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования по теме диссертации выполнены в годы в соответствии с тематическим планом НИР Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии РАСХН по заданиям: 04 «Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ»; 08.04. «Разработать новые экспресс - тесты и терапевтические препараты для эффективной системы мероприятий по диагностике, профилактике и терапии болезней органов размножения и молочной железы у коров и свиней, обеспечивающей снижение бесплодия маточного поголовья, получение жизнеспособного приплода и производство продукции высокого санитарного качества» (№№ гос. регистрации: ; 01.9.; 01.200.117018; 15070..06.8.002.3).
Лабораторные исследования проводились в отделах фармакологии, патоморфологии, патологии воспроизводства сельскохозяйственных животных, физико-химических методов исследования.
Производственные опыты выполнялись на базе хозяйств: АО «Яменское», , и Рамонского района, и Острогожского района, СХА «Родина» и СХА «Свобода» Россошанского района и Павловского района Воронежской области; СПК «Новая жизнь» Алексеевского района, », , колхоз им. Фрунзе Белгородского района Белгородской области; Добровского района и «Дружба» Грязинского района Липецкой области.
В проведении экспериментальных и научно-производственных работ использовали: самцов и самок беспородных белых мышей с массой тела 20,0±3,0 г (n=1800); самцов и самок белых крыс беспородных и линии Wistar с массой ,0±25,0 г (n=1650); кроликов разного пола породы шиншилла с массой тела от 2,1 до 2,5 кг (n=12); коров красно-пестрой и черно-пестрой пород (n=5417).
При проведении опытов на лабораторных и домашних животных соблюдались требования к врачебно-биологическому эксперименту (, 1965) по постановке контроля, подбору аналогов, одинаковому кормлению и содержанию животных в период исследований.
Антимикробную активность препаратов изучали in vitro методом серийных разведений (, 1986) в отношении референтных и полевых штаммов микроорганизмов – потенциальных возбудителей воспалительных заболеваний матки. Минимальную бактериостатическую концентрацию (МБсК) определяли в мясопептонном бульоне, минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) путем высева из пробирок с МПБ на плотные питательные среды. Содержание микробных клеток в 1 мл среды составляло 500 тыс.
Эксперименты по изучению острой, подострой токсичности, эмбриотоксичности, тератогенности и аллергенности выполнялись на белых нелинейных мышах и крысах обоего пола. Животные содержались в условиях вивария ГНУ ВНИВИПФиТ в стандартных пластиковых клетках (по 8-10 гол.) на подстилке из опилок лиственных пород деревьев в соответствии с правилами группового содержания. Температура воздуха поддерживалась в пределах 18-23°С, относительная влажность – 45-60%. Температура и влажность воздуха регистрировались ежедневно. Доступ к воде и корму был свободным. Рацион кормления животных соответствовал принятому в виварии ГНУ ВНИВИПФиТ. В опыты отбирали здоровых животных, группы формировали по принципу аналогов, используя в качестве критерия массу тела (различия по средней массе животных не превышало 10-12%).
Острую токсичность препаратов диометр, тетраметр и энроцид изучали на двух видах экспериментальных животных – белых мышах и крысах. Опыты выполнялись в двух повторностях для каждого вида животных. Препараты вводили однократно подкожно в следующих дозах: диометр и тетраметр от 4500,0 до 12500,0 мг/кг, энроцид – от 10000,0 до 24500, мг/кг в объеме 0,8 мл на мышь и 6,0 мл на крысу. Наблюдение за животными проводили непрерывно на протяжении первого дня после введения препаратов. В последующем состояние животных отмечали дважды в сутки в течение 14 дней. В ходе экспериментов учитывали внешний вид, поведение, поедаемость корма и прием воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений и глубину дыхания.
В основу подбора доз и определения параметров токсичности препаратов был положен принцип нахождения скользящих величин, вызывающих необходимый эффект: появление симптомов токсикоза или гибели особей в группах.
На первом этапе испытаний определялись недействующая и, абсолютно смертельная дозы. На втором этапе токсические дозы испытывались с интервалами в возрастающем по силе действия порядке, то есть, недействующая доза доводилась до величины 100 %-ной гибели особей.
Среднелетальную дозу - LD50 - определяли аналитическим способом Спирмена-Кербера (, 1990) и с помощью пробит-анализа с использованием прикладной программы «Статистика +2003». Величины LD16 и LD84 препаратов для белых мышей и белых крыс определяли графически на основании соответствующих пробитов и доз в мг/кг массы тела, показатель ошибки средней дозы эффекта - SLD50 - аналитически и графически.
При испытании токсических доз изучали симптомокомплекс острого экспериментального отравления препаратами и патологоанатомические изменения в органах и тканях животных.
Изучение подострой токсичности препаратов проводили на белых крысах самках с массой г при подкожном введении в течение 14 дней. Для каждого препарата было подобрано по 60 животных (три группы по 20 крыс). Расчет дозировок проводили по готовым лекарственным формам, исходя из ЛД50, установленной в остром опыте для каждого препарата и с учетом его плотности. В исследованиях использовали две дозы: 1/50 и 1/10 от ЛД50 соответственно: диометр – 167,5 и 837,5 мг/кг; тетраметр – 168,0 и 840,4 мг/кг и энроцид – 337,7 и 1688,4 мг/кг. На протяжении экспериментов отмечали: общее состояние (динамика массы тела); вегетативный статус (по состоянию слизистых, шерстного покрова, ширины глазных щелей, наличию саливации, диареи, опрятности животных). Гематологические (количество эритроцитов, лейкоцитов, уровень гемоглобина, лейкоцитарная формула) и биохимические (общий белок, глюкоза, общие липиды, креатинин, мочевина, холестерол, кальций, фосфор, активность ферментов: АсАТ, АлАТ и ЩФ) показатели изучали через сутки после последнего введения препаратов и через 7 суток после их отмены (восстановительный период). В эти же сроки крысы всех опытных групп были подвергнуты эвтаназии, производили взвешивание внутренних органов подопытных животных (печень, почки, сердце, легкие, селезенка, надпочечники, тимус) для выявления органа-мишени действия препаратов. После определения массы органов были рассчитаны их массовые коэффициенты и проведены их макроскопические и гистологические исследования.
Изучение безвредности (переносимости) препаратов диометр, тетраметр и энроцид проведено на 45 коровах красно-пестрой породы (по 15 животных на препарат), 3-5 отела, массой 500-550 кг, которые через 6-8 часов после самопроизвольного отделения последа были разделены на 3 группы по 5 животных. Коровы первой группы служили контролем, второй - внутриматочно вводили изучаемый препарат в терапевтической дозе (100 мл на животное), третьей – в дозе, в три раза превышающей терапевтическую (300 мл на животное). Препараты вводили в полость матки с помощью шприца Жане, предварительно подогрев до температуры 37-40°С.
Токсическое действие препаратов при их применении оценивали по клиническому состоянию животных, морфологическим и биохимическим показателям крови. Кровь для исследования брали у коров из яремной вены утром до кормления до введения препаратов и через 7 суток после однократного внутриматочного введения.
Изучение субхронической токсичности препаратов проведено на 45 коровах красно-пестрой породы (по 15 животных на препарат), 3-5 отела, массой 450-550 кг, которые через 6-8 часов после самопроизвольного или сразу после оперативного отделения последа были разделены на 3 группы по 5 животных. Коровы первой группы служили контролем, второй (опытная №1) - в течение 5 дней с интервалом 24 часа вводили внутриматочно изучаемые препараты в терапевтической дозе (100 мл на животное), и третьей (опытная №2) - в течение 5 дней с интервалом 24 часа вводили внутриматочно изучаемые препараты в 3-х кратно терапевтической дозе (300 мл на животное).
Токсическое действие препаратов при их применении оценивали по клиническому состоянию животных, морфологическим и биохимическим показателям крови. Кровь для исследования брали у коров из яремной вены утром до кормления в начале опыта и на 6-й день опыта (через сутки после последнего введения препаратов).
Раздражающее действие препаратов на кожу изучали в опытах на кроликах, которым наносили препараты в чистом виде. Площадь нанесения составляла 5% от общей поверхности тела животных. Реакцию кожи на воздействие препарата оценивали через 1 и 16 часов после однократного нанесения. Учитывали функциональные нарушения кожи, характеризующиеся появлением различной степени выраженности эритемы, отека, трещин, изъязвлений, изменением температуры тела.
В экспериментах степень эритемы учитывали визуально и оценивали в баллах. Величину отека определяли путем измерения толщины кожной складки и оценивали в баллах.
Для изучения влияния препаратов на конъюнктиву глаз были проведены опыты на кроликах породы белый великан. Клиническое состояние животных (температуру тела, частоту пульса, количество дыхательных движений), а также изменение кровенаполнения конъюнктивы, наличие выделений, состояние роговицы и век оценивали через 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 и 6 часов после инстилляции препаратов (табл. 1).
Таблица 1
Интенсивность реакции | Оценка в баллах | Раздражающий эффект |
Нет реакции | 0 | Отсутствует |
Слабая реакция | 2 | Слабый |
Выраженная реакция | 4 | Умеренный |
Лакримация | 6 | Слабо выраженный |
Наличие выделений | 8 | Выраженный |
Отек век | 10 | Сильно выраженный |
Изучение эмбриотоксического и тератогенного действия проведено по методике с соавт. (1977) на самках белых крыс (36 гол.) массой 200,0±10,0 г.
Изучение остаточных количеств диометра в молоке проведено по определению содержания диметилсульфоксида, диоксидина и канамицина; тетраметра - диметилсульфоксида, диоксидина и окситетрациклина; энроцида - диметилсульфоксида и энрофлоксацина. Количественное содержание диметилсульфоксида и диоксидина проводили при помощи газового хроматографа «Цвет», канамицина и окситетрациклина определяли микробиологическим методом диффузии в агар и энрофлоксацина в молоке крупного рогатого скота методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием.
Диагноз на послеродовый эндометрит у коров устанавливали в соответствии с «Методическими указаниями по диагностике, терапии и профилактике болезней органов размножения у коров и тёлок» (М.,2000).
Лечебную эффективность препаратов при послеродовом остром эндометрите у коров оценивали в Павловского района Воронежской области с использованием двух схем лечения (табл. 2 и 3).
Таблица 2
Препараты | Дни | ||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
Диометр (тетраметр, энроцид), внутриматочно, | 100 мл | 100 мл | 100 мл | * | |||||
Утеротон, в/мышечно | 10 мл | 10 мл | 10 мл |
* - при необходимости
Таблица 3
Препараты | Дни | ||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
ПДЭ, п/к | 25 мл | 25 мл | 25 мл | ||||||
15% раствор АСД-2Ф на тетрагидровите (тривите) | 10 мл | 10 мл | 10 мл | ||||||
Утеротон, в/мышечно | 10 мл | 10 мл | 10 мл | ||||||
Диометр (тетраметр, энроцид), внутриматочно | 100 мл | 100 мл | 100 мл |
При оценке эффективности лечения при остром послеродовом эндометрите коров всех групп животных учитывали общее состояние, объём и характер выделений из наружных половых органов, процент выздоровевших животных, сроки выздоровления, период от отёла до оплодотворения и коэффициент оплодотворения.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 |
