Извлечение органов и получение гомогенатов. По прошествии определенного времени с момента введения радионуклида животных убить декапитацией, вскрыть брюшную полость, извлечь печень и после охлаждения на льду определить ее массу. Взять навески печени (0,5—1,0 г), гомогенизировать в стеклянном гомогенизаторе с 4—5 или 9 мл холодной 0,6 н. хлорной или 5 % трихлоруксусной кислоты на льду или в холодной комнате.
Получение фракций кислоторастворимых соединений фосфора. Из промытого от кислоты осадка фосфолипиды экстрагировать различными органическими растворителями в аппарате Сокслета или путем кипячения в колбе на водяной бане с последующим центрифугированием. В последнем случае осадок перенести в круглодонную колбу с обратным холодильником и залить 20— 30 мл смеси спирта с эфиром (3:1). Колбу нагреть на водяной бане при кипячении смеси в течение 10—15 мин. После некоторого охлаждения содержимое колбы перенести в центрифужную пробирку, осадок отцентрифугировать при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость слить в чистую колбочку, осадок повторно обработать 20—30 мл смеси спирт — эфир (1:1) при кипячении и вновь центрифугировать при тех же условиях.
Оба экстракта объединить и выпарить в колбе Къельдаля под тягой на водяной бане (фракция фосфолипидов).
Получение фракции фосфора нуклеиновых кислот. Пробирки с осадками ткани обмыть снаружи теплой водой, чтобы удалить из осадка остатки эфира. Делать это надо очень осторожно, так как, если вода будет слишком горячая, осадок может оказаться выброшенным из пробирки и тогда весь опыт будет испорчен. После исчезновения запаха эфира пробирки поместить на кипящую водяную баню и при прошествии около 2 мин прилить к осадкам 2 мл 10%-ного раствора хлористого натрия. Пробирки закрыть маленькими воронками и оставить на кипящей водяной бане на 2 ч. После этого из пробирок пипетками осторожно отсосать раствор хлористого натрия, стараясь отобрать по 2 мл, то есть количество, которое было налито в пробирки. Растворы слить в пронумерованные цилиндрики.
Сухой остаток извлечь из пробирок полностью и разместить на нескольких чашечках-мишенях из алюминиевой фольги для счета. Чтобы слой вещества был очень тонким, используют не менее 2—3 чашек (если брали 0,5 г ткани), иначе даже в хорошо просушенных препаратах будет происходить большое самопоглощение. Следует отметить, что именно самопоглощение чаще всего бывает причиной неудачи в проведении описываемого опыта.
Таким образом, мы получаем следующие фракции для измерения радиоактивности: 1) гомогенат 100—150 мг сырой ткани в 5 мл 0,2 М хлористого натрия (общий фосфор ткани); 2) общий кислоторастворимый фосфор; 3) фосфор фосфолипидов (выпаренный экстракт); 4) фосфор нуклеиновых кислот; 5) сухой остаток.
Приготовление препаратов для определения радиоактивности. В пронумерованные мишени из алюминиевой фольги поместить диски фильтровальной бумаги и механической пипеткой внести по 0,3 мл экстракта из соответствующих пробирок (две параллельные пробы). Содержимое на мишенях подсушить при комнатной температуре или под лампой, но не при слишком высокой температуре. Таким же образом приготовить несколько эталонных препаратов из стандартного раствора изотопа. Радиоактивность всех препаратов измерить при строго одинаковых условиях. При помощи таблицы Белла определить, сколько времени надо считать каждый препарат, чтобы получить результаты с точностью до 5 %.
Для записи полученных экспериментально и рассчитанных данных составить таблицу с указанными названиями граф: 1) № п/п; 2) название фракции; 3) общий объем фракции (мл); 4) какому количеству ткани соответствует общий объем фракции; 5) радиоактивность 0,3 мл фракции, взятых для счета (имп/мин); 6) удельная активность фракции (имп/мин/г сырой ткани).
Упражнение 3. Исследование накопления калия в мышцах при физической нагрузке.
Известно, что во время работы скелетные мышцы поглощают из внутренней среды организма большое количество калия. Для доказательства этого положения в данном упражнении предлагается использовать радиоактивный калий-42.
Материалы и оборудование: подопытные животные (крысы), радионуклид калий-42, шприц на 1 мл, скальпель, ножницы, пинцет, кювета с экраном из оргстекла, весы, стеклянные банка или ведро, спецодежда, чашки Петри, мишени из фольги, радиометрическая установка.
Выполнение работы.
1. Введение калия-42 животным, создание физической нагрузки. Двум крысам вводят подкожно раствор радиоактивного калия-42 в количестве 0,05—0,07 МБк на 100 г массы. Расчет активности на день опыта и количество радионуклида для введения животным проводят тем же порядком, что и в упражнении 1. Через 10 мин после инъекции одну из крыс помещают в сосуд с водой (например, в наполовину налитое ведро), в котором она будет плавать 30—40 мин. Вторая крыса остается в это время в клетке в спокойном состоянии.
2. Приготовление препаратов мышц для радиометрии, измерение радиоактивности. Через 30—40 мин или раньше (если плавающая крыса начинает тонуть) обоих крыс убивают декапитацией. Из мышц бедра берут несколько навесок по 100 мг, тщательно измельчают, равномерно распределяют на мишенях из фольги, подсушивают и измеряют радиоактивность с помощью счетчика СБМ-20 или МС-6 с точностью до 5 %. Радиометрию препаратов проводят способом, описанным в упражнении 1.
Выражение результатов опыта. Для удобства сравнения результаты радиометрии выражают в импульсах, распадах в минуту на 1 г ткани или рассчитывают, во сколько раз больше калия поглощает работающая мышца, чем мышца покоя. Для записи результатов удобно пользоваться формой указанной в лаб. работе 1.
3. РАДИОНУКЛИДЫ В ИЗУЧЕНИИ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА
Лабораторная работа 3. Изучение белкового обмена у животных с помощью меченых аминокислот.
Белковый обмен — один из основных видов обмена веществ. Любое заболевание всегда в той или иной степени отражается на состоянии белкового обмена. Многие заболевания являются следствием расстройства этого обмена. В исследовании белкового обмена решающее значение имеет радионуклидный метод. Типичный опыт с мечеными аминокислотами состоит в том, что соответствующую аминокислоту вводят животным через рот, подкожно или внутривенно. Через разные сроки после этого животных убивают, выделяют из тканей белки и исследуют их радиоактивность. Такие опыты показали, что меченые аминокислоты входят в белки всех органов и тканей, но не в одинаковых количествах и с разной скоростью.
Радионуклидный метод вместе с другими методами позволяет выяснить индивидуальную судьбу каждой аминокислоты в организме и даже проследить за поведением каждого атома, занимающего определенное место в молекуле кислоты. В этом его несомненная ценность при выяснении механизмов нарушений как белкового, так и тесно с ним связанных других видов обмена.
В настоящей лабораторной работе предлагается выполнить упражнения, которые дают практические навыки использования меченых аминокислот в изучении белкового обмена.
Упражнение 1. Включение меченых аминокислот в тканевые белки животных.
Для выполнения данного упражнения необходимо подробно ознакомиться с методикой выделения белка, провести подготовительные мероприятия к опыту, исходя из данных паспорта рассчитать активность и количество радионуклида, необходимое для введения каждому животному.
К данному упражнению необходимо приготовить несколько растворов.
Биуретовый реагент. Растворить 1,5 г сульфата меди и 6 г натрий-калий виннокислый (сегнетова соль) NaKC4H4O6 в 500 мл дистиллированной воды. Прилить при помешивании 300 мл 10 % NaOH, свободного от СО2, и разбавить в 1л пластиковой бутыли. Добавить 0,1 % KJ и оставить при комнатной температуре. Этот реактив устойчив до 6 мес.
Белковый стандарт. Растворить 200 мг сывороточного альбумина в 20 мл 0,3 н. КОН (1 мл — 10 мг альбумина). Приготовленный раствор использовать для построения калибровочного графика (см. ниже).
Стандарт РНК и ДНК. Растворить 20 мг РНК или ДНК в 100 мл 0,3 н. КОН. Приготовленные растворы РНК и ДНК использовать для построения калибровочного графика, разбавляя их хлорной кислотой, как описано ниже.
Радиоактивный углерод 14С. Растворить смесь меченных С-14 аминокислот 0,86 NaCl до концентрации 0,5 МБк на 1 мл, если работа проводится на крысах, и до 0,1 МБк в 1 мл, если работа проводится на мышах.
Сцинтилляционная среда. Растворить 6 г 2,5 дифенилоксазола (РРО), 0,1 г 1,4-ди-(4-метил-5-фенилоксазол) - бензол - (диметил) (РОРОР) в 80 г нафталина в 1 л толуола.
Материалы и оборудование: мыши или крысы, гомогенизатор стеклянный, центрифуга для малых объемов (3—6 тыс. об/мин), спектрофотометр, фотоэлектрокалориметр, термостат на 37 °С, холодильник, весы торзионные или аналитические, приборчик для получения стандартных осадков, водоструйный насос, радиометр, шприц на 1—2 мл, зажимы — корнцанги или др., ножницы большие и малые, скальпели, штативы для центрифужных пробирок, груши для пипеток, широкогорлые банки для животных, колбы Бунзена, центрифужные пробирки на 10 мл, пипетки на 1,2 и 5 мл, мерные колбы на 100 и 500 мл, стеклянные палочки, предметные стекла, бачок для радиоактивных отходов, колбочки плоскодонные на 100 мл, чашки Петри, радиоактивный углерод 14С (меченые аминокислоты), хлористый натрий 0,85 %, сульфат меди, натрий-калий виннокислый, едкий натр 10 %, калий йодистый, трихлоруксусная кислота (ТХУ) 50, 20 и 10 %, насыщенный ацетатом натрия этиловый спирт, этиловый спирт 95 %, эфир, едкое кали (0,3 н.), сывороточный альбумин, толуол, нафталин сцинтилляционный, РРО, РОРОР, марля, лед, фильтровальная бумага, нитроцеллюлозные фильтры № 2 или 4, фильтры «синяя лента», индикаторная бумага, клей, карандаш по стеклу, линейка, порошок «Защита», салфетки бумажные для вытирания рук, вата.
Выполнение работы.
1.Введение радионуклида, извлечение органов и получение гомогената. Приготовить рабочий раствор смеси аминокислот (или одной аминокислоты), меченных углеродом-14 или серой-35, удельной активностью 0,1—0,5 МБк/мл (зависит от массы животного). Приготовленный раствор меченых аминокислот ввести животным (мыши или крысы) внутрибрюшинно с помощью шприца на 1—2 мл из расчета 0,4 МБк на 100 г массы животного. Через 1—2 ч после введения радионуклида животных убить декантированием, взять пробы различных тканей в чашки Петри, находящиеся на льду. Навески ткани (0,5—1,0 г) гомогенизировать в холодной дистиллированной воде 1:4 (1 г ткани + 4 мл дистиллированной воды), гомогенат заморозить. Затем образцы оттаять и добавить 8 мл холодной 10 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ) на 1 мл гомогената.
Образовавшийся осадок отделить центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин и 4 °С. Осадок последовательно промыть 2 раза 5 мл холодной 10 % ТХУ. Для удаления остатков ТХУ и липидов осадок экстрагировать 5 мл 95 % этанола, насыщенного ацетатом натрия. Дополнительную экстракцию липидов провести 5 мл смеси спирт — эфир (3:1) и 5 мл эфира. Остаток эфира удалять с помощью высушивания осадка на воздухе в течение 5—10 мин. К влажному осадку добавить 4 мл 0,3 н. КОН и поместить в термостат на 1 ч при 37 °С. Полученный гидролизат использовать для определения концентрации белка, нуклеиновых кислот и радиоактивности белка.
2 Определение концентрации белка. В стеклянные пробирки отобрать 1 мл гидролизата, туда же прибавить 4 мл биуретового реагента, оставить на 30—40 мин в затемненном месте. Интенсивность окраски измерить при 540 нм (зеленый светофильтр) на ФЭК-М или СФ-16 с лампой накаливания. В качестве контроля использовать 1 мл 0,3 н. КОН + 4 мл биуретового реагента. Общее количество белка определить по калибровочному графику. Для его построения растворить 20 мг сывороточного альбумина в 20 мл 0,3 н. КОН (белковый стандарт). В 10 стеклянных пробирок отобрать белковый стандарт в объеме от 0,1 до 1 мл, в каждую пробирку добавить 0,3 н. КОН до 1 мл и 4 мл биуретового реагента. Через 30 мин измерить интенсивность окраски при 540 нм (зеленый светофильтр) на ФЭК-М или СФ-16 с лампой накаливания. Оставшиеся 3 мл гидролизата использовать для определения радиоактивности белка и концентрации нуклеиновых кислот.
3.Определение радиоактивности белка. Для определения радиоактивности белка отобрать 1 мл гидролизата в стеклянные пробирки, добавить 50 % трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5—10 %. Через 5 мин осадок отфильтровать через миллипоровые нитроцеллюлозные фильтры (0,45 мкм) на специальном приборчике для получения стандартных осадков с подключением вакуума (водоструйный насос). Чтобы фильтр не прорвался, под основной диск подложить фильтр из обычной фильтровальной бумаги. Осадок на фильтре трижды промыть 10 % раствором ТХУ и 1 раз 70 % этанолом. Фильтры с равномерным слоем осадка поместить в сцинтилляционные флаконы, высушить на воздухе, прилить 5—10 мл сцинтилляционной жидкости (1 л толуола, 6 г РРО, 0,1 г РОРОР и 80 г нафталина) и измерить радиоактивность с помощью сцинтилляционных счетчиков. Если последних в лаборатории нет, радиоактивность белка можно определить на обычных радиометрах с торцовым счетчиком. Радиоактивность всех препаратов измеряют на одной и той же установке в одинаковых геометрических условиях и выражают в импульсах в минуту на 1 мг белка.
4.Определение концентрации нуклеиновых кислот. Для разделения РНК и ДНК отобрать 2 мл гидролизата, добавить 1 мл холодной 60 % хлорной кислоты. Через 5 мин образовавшийся осадок отцентрифугировать при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость осторожно перелить в чистые стеклянные пробирки и использовать для определения концентрации РНК. Осадок промыть 2 раза 5 мл холодной 5 % хлорной кислотой, залить 96 % этанолом и оставить для определения концентрации ДНК.
Для определения концентрации РНК отобрать 1 мл надосадочной жидкости в стеклянные пробирки и разбавить до 10 мл 0,5 н. раствором хлорной кислоты, измерить оптическую плотность на спектрофотометре при 260 нм. В качестве контроля использовать 0,5 н. раствор хлорной кислоты. Общее количество РНК определить по калибровочному графику (см. ниже).
Для определения концентрации ДНК к оставшемуся осадку добавить 1,5 мл 0,5 н. хлорной кислоты и поместить в термостат при 96 ± 1°С на 45 мин для гидролиза. Затем образцы охладить, отцентрифугировать при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость слить в калиброванные пробирки, осадок промыть 2 раза 1 мл 0,5 н. хлорной кислоты. Промывные жидкости объединить с надосадочной жидкостью и довести объем до 10 мл. Измерить оптическую плотность на спектрофотометре при 265 и 290 нм против (Контроля (0,5 н. хлорная кислота, прогретая таким же образом, как пробы). Общее количество ДНК определить по калибровочному графику.
Для построения калибровочного графика на РНК и ДНК растворить 20 мг РНК или ДНК в небольшом количестве 0,3 н. раствора КОН, поместить в колбочку на 100 мл и разбавить до метки 0,3 н. раствором КОН. Из этих стандартных растворов отобрать в 10 стеклянных пробирок объемы от 0,1 до 1 мл, в каждую пробирку добавить 0,3 н. раствор КОН до 1 мл и 9 мл 0,5 н. раствора хлорной кислоты. Измерить оптическую плотность на спектрофотометре при 260 нм для РНК и 265 и 290 нм для ДНК.
Упражнение 2. Использование 14С-аминокислот для определения белоксинтезирующей активности изолированных клеточных ядер.
Для выполнения данного упражнения необходимо подробно ознакомиться с методами выделения клеточных ядер из печени и определения белоксинтезирующей активности, провести подготовительные мероприятия к опыту, рассчитать количество радионуклида, необходимое для внесения в пробу. После этого убить животных декапитацией, извлечь печень, выделить клеточные ядра, инкубировать их с 14С-аминокислотами и измерить радиоактивность кислотнорастворимой фракции.
Материалы и оборудование: натрий хлористый, сахароза, магний хлористый, калий фосфатный буфер с рН 6,5, кальций хлористый, трихлоруксусная кислота, меченые аминокислоты, сывороточный альбумин, глюкоза, центрифуга с охлаждением, радиометр, водоструйный насос, пробирки центрифужные, термостат на 37°С, водяная баня, приборчик для получения стандартных осадков, фильтры «Сынпор» с диаметром пор 0,24 мкм, колба Бунзена.
Выполнение работы.
1. Выделение клеточных ядер. После убоя животных (крыс) извлечь печень, промыть ее охлажденным физиологическим раствором, поместить в чашку Петри, освободить от сосудов и соединительной ткани, измельчить ножницами и гомогенизировать. Делают это в среде выделения в соотношении 1 : 10 с помощью стеклянного гомогенизатора с тефлоновым пестиком. Средой выделения служит 0,20 М раствор сахарозы (рН 7,4), содержащий 0,02 М ЭДТА. Гомогенат отфильтровать через 2 слоя марли, перенести в центрифужный стакан и отцентрифугировать на ЦЛР-1 при 2500—3000 об/мин в течение 10 мин. Осадок дважды гомогенизировать в 30 мл среды выделения и центрифугировать при тех же условиях. После последнего центрифугирования осадок ядер растворить в 5 мл среды выделения, перенести в стеклянные пробирки и использовать для определения белоксинтезирующей активности.
2. Определение белоксинтезирующей активности клеточных ядер. Из суспензии клеточных ядер отобрать в конические центрифужные пробирки такие количества, в которых содержалось бы 100 мкг ДНК. Отцентрифугировать при 2500 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбросить, осадок суспендировать в 0,5 мл 0,1 М калийфосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 0,25 М сахарозы, добавить 0,4 мл 0,1 М раствора глюкозы, содержащего 0,025 М магния хлористого. Туда же добавить 1 мл 2 М раствора хлористого кальция и 3,7×104 Бк 14С-аминокислот (гидролизат белка). Общий объем суспензии 2 мл.
Пробы поместить в термостат при 37 °С на 1 ч. Затем смесь охладить, добавить 10 мкг бычьего альбумина и 2 мл 20 % раствора ТХУ. Через 5 мин смесь отцентрифугировать, надосадочную жидкость слить. Осадок суспендировать в 10 мл 20 % раствора ТХУ и поместить в кипящую водяную баню на 15 мин. Смесь охладить и отфильтровать через мембранные фильтры «Сынпор», диаметр пор 0,24 мкм. Осадок на фильтре промыть 2—4 раза 5 мл 5 % раствора ТХУ. Фильтры высушить на воздухе, измерить радиоактивность на сцинтилляционном счетчике и выразить результаты (в имп/мин) на взятое в пробу количество ДНК.
4. РАДИОНУКЛИДЫ В ИЗУЧЕНИИ ОБМЕНА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Лабораторная работа 4. Исследование биосинтеза (по скорости включения 32Р) высоко - и низкополимерных фракций РНК у животных в норме и при действии ионизирующей радиации
Цель: Ознакомить студентов с применением радиоактивного фосфора 32Р для изучения одной из центральных проблем биохимии — обмена нуклеиновых кислот клетки и проследить изменения, которые происходят в обмене нуклеиновых кислот при действии ионизирующей радиации. Изучение этих изменений представляет большой интерес и при других патологиях животных, т. к. нуклеиновые кислоты принимают непосредственное участие во многих важнейших процессах жизнедеятельности клетки.
Содержание занятия. Перед началам работы студенты должны внимательно прочитать предлагаемую методику, составить план предстоящей работы, подготовить рабочие места, необходимые реактивы, рассчитать активность и приготовить рабочий раствор радиофосфора (см. выше, лаб. Работа 1). После введения животным радиофосфора убить их декапитироваиием, отобрать пробы тканей, выделить и очистить соответствующие фракции РНК, определить их концентрацию, а затем приготовить счетные образцы РНК для намерения радиоактивности.
Порядок выполнения работы.
Приготовить рабочий раствор радиоактивного фосфора 32Р (можно использовать отдельные нуклеотиды, меченные углеродом 14С или тритием 3Н) активностью 4— 20 МБк/мл (зависит от массы животного), ввести приготовленный раствор радиоизотопа животным, (мыши или крысы) внутрибрюшинно с помощью шприца на 1—2 мл из расчета 20—40 кБк на грамм массы животного (время введения записать).
Через час после введения изотопа животное убить декапитацией, из брюшной полости извлечь печень и поместить ее в чашки Петри, находящиеся на льду. Скальпелем или ножницами печень измельчить и гомогенизировать в стеклянном или тефлоновом гомогенизаторе в десятикратном объеме охлажденного 0,01 М ацетатного буфера рН = 5,1, содержащего 0,5 % додецилсульфата натрия (лучше все эти операции проводить в холодной комнате при температуре 2—4°С либо на льду).
Гомогенат слить в колбу на 300 или 100 мл, смешать с равным объемом свежеперегнанного фенола, после чего смесь инкубировать на водяной бане при 60° в течение 5 мин при постоянном встряхивании. Затем смесь охладить и центрифугировать на холодумин при 2500 об/мин. Верхнюю фазу осторожно перенести в чистые колбы на 100 или 300 мл и осадить РНК тремя объемами холодного этилового спирта. Осадок РНК отделить центрифугированием при условиях, описанных выше, и растворить в 10 мл дистиллированной воды. К раствору РНК добавить NaCl до конечной концентрации 0,15 М и РНК вновь осадить тремя объемами холодного спирта. Такое переосаждение повторить еще два раза. После третьего перосаждения РНК снова растворить в дистиллированной воде (5 мл), к раствору PHK добавить равный объем 3 М NaCl, раствор перемешать и оставить в холодильнике на ночь.
На следующее утро выпавший осадок высокополимерной РНК собрать центрифугированием (15 мин 2500 об/мин), растворить в дистиллированной воде (5 мл). Иногда можно провести еще одно переосаждение спиртом. Надосадочную жидкость слить в колбы на 100 мл и залить тремя объемами холодного этанола (для осаждения низкополимерной РНК клетки), поместить в холодильник на 1—2 часа, после чего центрифугировать в тех же условиях и растворить в 5 мл дистиллирован мой воды.
Хранить растворы в закупоренных пробирках в замороженном состоянии. Из полученных растворов РНК отбирать пробы для определения концентрации РНК и ее удельной радиоактивности.
Определение концентрации высокополимерной и низкополимерной РНК.
В соответствующее количество пробирок (удобно пользоваться градуированными пробирками) налить 5,9 мл дистиллированной воды. Микропипеткой в каждую из пробирок внести по 0,1 мл соответствующего раствора РНК. Содержимое пробирок тщательно перемешать, затем произвести измерение поглощения ультрафиолетового излучения полученными растворами при длинах волн 260 и 290 им на спектрофотометре. В контрольной кювете — дистиллированная вода. Измерения проводить в средней части шкалы прибора (Е = 0, 1 — 0,8). Расчет концентрации РНК в растворах, непосредственно поступающих на фотометриравание, произвести по следующей формуле: с = ∆260х40, где с—концентрация РНК в фотометрируемом растворе в γ на мл, ∆260 — разность экстинкций при 260 и 290 нм, 40 — эмпирический коэффициент. Концентрацию РНК в исходном растворе рассчитать с учетом разведений по формуле:
Где:
С — концентрация РНК в исходном растворе в g на мл;
с—концентрация РНК в непосредственно фотометрируемом растворе (см. выше);
5 —объем непосредственно фотометрируемого раствора в мл;
0,1 —количество исходного раствора, взятого для приготовления фотометрируемого раствора в мл.
Определение удельной радиоактивности растворов РНК
Из растворов РНК с известной концентрацией отобрать пипеткой в чистые пробирки объем, содержащий около 1мг РНК. Взятые объемы записать. Объемы жидкости в пробирках довести до 2 мл дистиллированной водой и охладить в ледяной бане. РНК осадить 50 % трихлоруксусной кислотой (ТХУ вносить с таким расчетом, чтобы конечная ее концентрация в пробирке составила 5 %).
После 5 минутного стояния в ледяной воде осадки отфильтровать через миллпоровые фильтры с диаметром пор 0,45мк (под фильтр подкладывается кусочек обычной фильтровальной бумаги) на специальном приборчике для получения стандартных осадков.
Осадок на фильтре 3—4 раза промыть холодной 5 % хлорной или трихлоруксусной кислотой и один раз холодным спиртом. После этого фильтр с осадком осторожно снять и наклеить резиновым клеем на плотную бумагу или предметное стекло. Радиоактивность всех приготовленных счетных образцов определить на одной и той же радиометрической установке в одинаковых геометрических условиях и выразить в имп/мин. Рассчитать удельную активность РНК в имп/мин/мг.
Определение нуклеотидного состава РНК
а) Гидролиз РНК
После определения радиоактивности нитроцеллюлозные фильтры с осадками РНК поместить в малые центрифужные пробирки с коническим дном, где РНК освобождается от материала фильтра, который хорошо растворам в ацетоне. Для этого в пробирку налить 1 мл ацетона и содержимое пробирки перемешать. Осадок РНК отделить центрифугированием (10—15 мин, 3000 об/мин). Обработку ацетоном повторить еще один - два раза.
Осадки РНК подсушить в термостате при 37 °С, залить 5,0 мл 0,5 н КОН и осторожно перемешать запаянным капилляром или тонкой стеклянной палочкой, пробирки закрыть пробками и поместить в термостат при 37 °С на 18 часов. Удобно оставлять пробирки в термостате с 3 часов дня до 9 часов утра.
б) Подготовка гидролизата к хроматографии
При щелочном гидролизе РНК расщепляется до хорошо растворимых мононуклеотидов; не гидролизовавшиеся примеси (полисахариды, ДНК) осадить добавлением в гидролизат 57 % хлорной кслоты до рН = 3 на холоду. Во избежание избытка кислоты последнюю вносить очень небольшими порциями, с помощью пастеровской пипетки, затем кислоту осторожно выдуть в гидролизат. После перемешивания осторожным пробулькиванием той же пипеткой гидролизат нанести на узенькую (1мм) полоску универсальной индикаторной бумажки. Кислоту добавлять до порозовения бумажки при очередной пробе. Пробирки поместить на 5 минут в ледяную воду, затем осадок отделить центрифугированием (10—15 мин, 3000 об/мин). Надосадочную жидкость (гидролизат) пастеровской пипеткой перенести в чистую малую центрифужную пробирку, нейтрализовать до рН = 7,0 сначала 5 н, а затем 0,6 н раствором КОН. Раствор щелочи вносить пастеровской пипеткой, рН определить универсальной индикаторной бумажкой до желтой окраски, как описано выше. Нейтральный гидролизат выдержать в холодильнике в течение нескольких часов, посте чего выпавший осадок перхлората калия отделить центрифугированием и отбросить. Гидролизат снять с осадка соли пастеровской пипеткой и хранить в закупоренной пробирке в замороженном состоянии.
Концентрацию нуклеотидов в полученном гидролизате определить на спектрофотометре. Для этого пипеткой на 0,1 мл отобрать 0,01 мл гидролизата, кончик пипетки осторожно обтереть кусочком фильтровальной бумаги и взятый объем внести в пробирку с 5,0 мл дистиллированной воды. Раствор перемешать и спектрофотометрировать при длине волны 260 и 290 нм. Для нанесения на стартовое пятно хроматограммы необходимо брать такое количество гидролизата (X), которое соответствует разности поглощений при длинах волн 260 и 290 нм, примерно 0,7, т. е.
Разделение нуклеотидов
Разделение нуклеотидов можно производить с помощью ионообменной хроматографии на колонках или тонкослойной хроматографии на целлюлозе. Однако при использовании данных методов возникают трудности определения радиоактивности нуклеотидов. Эти трудности отпадают если разделение нуклеотидов проводить с помощью хроматографии или электрофореза на бумаге. Поэтому ниже дается описание этих методов.
а) Разделение рибомононуклеотидов с помощью хроматографии на бумаге.
Перед использованием бумагу разрезать на листы размером 20 х 55 см, поместить в специальную ванночку из плексигласа с дырчатым дном (типа воронки Бюхнера) и промыть сначала 2 н раствором уксусной кислоты, а затем до нейтральной реакции дистиллированной водой. Для промывания 20 листов бумаги указанного выше формата, как правило, достаточно 1,5—2 л 2 н раствора СН3СOОH при медленном пропускании уксусной кислоты через слой листов бумаги. На промытой и высушенной на воздухе бумаге разметить простым карандашом (вдоль листа) 4 полосы шириной 5 см и в середину 3 полос (одна остается контрольной) на расстоянии 8—10 см от верхнего края листа небольшими порциями при подсушивании нанести 100—1000 мкл раствора рибомононуклеотидов в виде пятна диаметром около 1см.
Разделение нуклеотидов производят путем последовательного пропускания в одном и том же направлении двух различных растворителей (нисходящая хроматография).
Первый растворитель состоит из этанола (4 объема), бутанола (1 объем) и 1 М ацетатно-аммониевого буфера рН = 3,7—3,8 (2 объема). После пропускания этого растворителя в течение 20-24 часов (на вытекание) хроматограмму высушить на воздухе и поместить во второй растворитель — изомасляную кислоту, насыщенную водой при температуре 15 °С и доведенную до рН = 3,5—4,0 концентрированным аммиакам.
В этой системе разделение нуклеотидов продолжать в течение 20—24 часов при комнатной температуре. В результате пропускания этих растворителей происходит разделение рибомононуклеотидов в следующем порядке (сверху вниз): гуаниловая, уридиловая, цитидиловая, аданиловая кислоты.
б) Разделение рибомононуклеотидов с помощью электрофореза на бумаге
Для электрофореза использовать хроматографическую бумагу Б (быстрая). Бумагу предварительно промыть точно таким же образом, как описано ранее (см. «Разделение рибомононуклеотидов с помощью хроматографии на бумаге»), разрезать на 4 полоски шириной 4 см и закрепить в специальной камере для электрофореза.
На смоченную буферным раствором полоску бумаги (4,0 см) и 8 см от катодного конца микропиеткой нанести в один прием 100—400 мкл раствора, содержащего рибомононуклеотиды. Нанесение такого большого количества жидкости на влажную полоску бумаги без подсушивания возможно благодаря тому, что раствор наносят между двумя поперечными линиями, очерченными мягким простым карандашом, в результате графит препятствует растеканию жидкости на бумаге. При нанесении такого большого количества раствора с подсушиванием или просто на сухую бумагу удовлетворительного разделения нуклеотидов не происходит.
В настоящее время используют самые различные условия электрофоретического разделения рибомононуклеотидов на бумаге. Однако опыт показывает, что наиболее надежное и сравнительно быстрое разделение рибомононуклеотидов происходит в течение 5 часов в 0,05—0,07 М ацетатно-аммониевом буфере рН = 3,5 при градиенте напряжения 16—18 в/см.
Ацетатно-аммониевый буфер готовят титрованием 2 М раствора уксусной кислоты (химически чистой) концентрированным аммиаком до рН = 3,5. В таком виде буферная смесь может относительно долго храниться при комнатной температуре без существенного изменения. Перед употреблением буферный раствор разбавить водой до концентрации 0,05-0,07М.
В указанных выше условиях электрофореза нуклеотиды четко разделяются между собой и отделяются от пигментированных веществ. Порядок расположения нуклеотидов от катода к аноду следующий: цитидиловая, адениловая, гуаниловая и уридилоая кислоты.
Определение радиоактивности отдельных нуклеотидов РНК
Пятна нуклеотидов на хроматограммах или электрофореграммах обнаружить с помощью ультрахемископа по поглощению ультрафиолетового совета. При этом следует избегать смотреть незащищенными глазами на свет ультрахемископа. Пятна очертить карандашом и затем аккуратно вырезать. Радиоактивность нуклеотидов может быть определена непосредственно в пятнах или в растворе после элюции.
В первом случае из центра пятна круговым ножом вырезать диск пo размеру окна детектора (площадь~ 2,5 см2). Оставшиеся обрезки пятна симметрично положить поверх диска, прижать к нему и в таких условиях произвести измерение радиоактивности нуклеотида. Если активность достаточно велика (более 500—1000 имп/мин на пятно), ее можно измерить после элюции.
Для элюции пятна нарезать мелкими кусочками, поместить в пробирки на 8—10 мл с пробками и залить 5 мл фосфатного буфера рН = 7 (1 М для хроматограмм, 0,5 М — для электрофореграмм). Элюцию проводить в термостате при 37 °С в течение ночи. Элюаты просветлить центрифугированием, нанести на мишени из фольги по 0,5 мл, выпарить под лампой и просчитать радиоактивность. При этом ошибка определения скорости счета не должна превышать 5 %.
Отношение активности четырех нуклеотидов, определенной в одинаковых геометрических и прочих условиях, соответствуют нуклеотидному составу вновь образованной РНК данной фракции. Результаты измерения скорости счета нуклеотидов и соответствующих расчетов вносятся в приведенную ниже таблицу.
Определение нуклеотидного состава общей РНК данной фракции.
В условиях данного опыта нуклеотидный состав - вновь образованной ядерной РНК не должен существенно отличаться от нуклеотидного состава всей РНК соответствующей фракции. Поэтому, определив нуклеотидный состав общей РНК и сравнив его с соответствующей величиной вновь образованной РНК, можно проконтролировать правильность полученных в предыдущем разделе результатов. Для определения нуклеотиднсго состава общей РНК фракции элюаты нуклеотидов спектрофотометриравать при следующих длинах волн: гуаниловая кислота при 255 и 290, адениловая — 260 и 290, цитидилавая — 270 и 290, уридиловая 260 и 290 нм.
В контрольную кювету налить элюаты с соответствующих контрольных участков хроматограмм. Для расчета количества нуклеотидов пользуются следующими коэффициентами:
Расчетные коэффициенты для нуклеотидов
Нуклеотиды | Количество нуклеотидов в мкМ на 5 мл элюата |
А | 0,470хD255 |
Г | 0,363хD260 |
Ц | 0,730хD270 |
У | 0,515хD260 |
D - разность между поглощением при указанной длине волны и при 290 нм.
Результаты внести в таблицу:
№п/п | Название фракции | Концентрация РНК в готовых растворах, в g/мл | Объем, взятый для приготовления препарата в мл | Концентрация РНК, мг | Скорость счета в имп/мин | Удельная ативность РНК, имп/мин на 1 мг | Относительная ошибка, % |
Оснащение занятия
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
