Необходимое оборудование. Центрифуга для больших объемов (3000 об/мин). Центрифуга для малых объемов (6000 об/мин). Шюттель-аппарат. Термостатический аппарат для встряхивания. Спектрофотометр. Радиометрическая установка. Хроматографические камеры. Ультрахемисокоп. рН-метр. Термостат на 37° С. Холодильник. Весы торзионные или аналитические. Приборчик для получения стандартных осадков. Водоструйный насос. Стеклянный или тефлоновый гомогенизатор. Эмалированные кюветы. Шприц на 1—2 мл. Зажим-корнцанги или др. Ножницы большие и малые. Скальпели. Штативы для пробирок. Микропипетки на 50 – 1000 мкл. Бачок для отходов.
Посуда. Широкогорлые банки для животных, колба Бунзена, центрифужные пробирки всех размеров, центрифужные пробирки конические, микропипетки на 0,1—0,2 мл. Пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл, пастеровские пипетки (много), мерные колбы на 100, 500 и 200 мл. Колбы конические на 100, 300, 500 мл (несколько), стеклянные палочки, агрегат для перегонки фенола, предметные стекла.
Реактивы. Радиоактивный фосфор, бутиловый спирт, свежеперегнанный фенол, додецилсульфат натрия, бидистиллят, доведенный до - рН = 7,0 (КНСОз), хлористый натрий х. ч. кристаллический, трихлоруксусная кислота 50% и 5%, РНК-носитель (р-р 1 мг/мл делается перед употреблением), едкий калий 0,5н, ацетатный буфер 0,01 М рН = 5,1, этиловый спирт, ацетон.
Лабораторная работа 5. Применение радионуклидов для изучения биосинтеза цитоплазматических и ядерных фракций РНК в организме облученных животных
Цель занятия: С помощью радиоактивных изотопов(32Р или меченых предшественников) изучить радиационно-биохимические изменения, которые происходят в цитоплазматических и ядерных фракциях РНК печени облученных животных.
Содержание занятия. Данная работа выполняется после подробного изучения на предыдущих занятиях основных приемов работы с радиоактивными веществами и теории данного вопроса. Основные приемы работы с радиоактивными веществами студенты осваивают на предыдущих занятиях (лаб. работа 1).
При выполнении данной работы предстоит проделать довольно длинный ряд препаративных манипуляций по выделению и очистке соответствующих фракций РНК. Перед началом работы внимательно прочитать предлагаемую методику, ознакомиться с приведенной литературой и составить план предстоящей работы. Следует помнить, что небрежность, допущенная в процессе работы, может свести на нет результаты многодневного труда.
Соблюдать необходимые меры предосторожности!
Порядок выполнения работы.
1. Приготовление раствора радиофосфора и затравка животных
Рассчитать активность и приготовить рабочий раствор радиофосфора (или меченых нуклеотидов, см. лаб работу 1) активностью 1××106 Бк/мл. Ввести приготовленный раствор радиоизотопа животным (мыши или крысы) внутрибрюшинно с помощью шприца на 1—2 мл из расчета 0,5×104 Бк на грамм массы животного (время введения записать).
2. Получение гомогената
Через час после введения радиофосфора животных убить путем декапитации (обезглавливания), у крыс вскрыть брюшную полость и провести обескровливание печени введением физиологического раствора. Затем печень извлечь и охладить на льду, либо заморозить сухим льдом или жидким азотом. Охлажденную печень измельчить скальпелем или ножницами, замороженную печень осторожно растереть в ступке.
В стеклянный или тефлоновый гомогенизатор налить охлажденный 0,14 М раствор хлористого натрия и порциями поместить предварительно измельченную печень. Гомогенизацию провести в несколько приемов с механическим приводом или от руки. Гомогенат быстро отфильтровать через 2 слоя марли, марлю промыть небольшой порцией (20—30 мл) 0,14 хлористого натрия.
3. Разделение цитоплазматических и ядерных фракций РНК
К гомогенату печени добавить paвный объем охлажденного свежеприготовленного водонасыщенного фонола, доведенного 0,5 н КОН до pH=6,0. Смесь в закрытой колбе поместить в аппарат для встряхивания и встряхивать в течение 15—25 мин на холоду. Затем водную и фенольную фазы разделить центрифугированием при 2500 об/мин в течение 30 мин.
Верхний водный слой содержит РНК цитоплазмы и полисахариды, промежуточная белая прослойка — ядерный материал (фенольные ядра), в фенолом слое сосредоточены белки.
Верхний водный слой перенести пипеткой в коническую колбу. Промежуточный слой осторожно отделить палочкой от стенок пробирки и перенести в другую коническую колбу. Фенольный слой отбросить. Водную фазу и промежуточный слой использовать для дальнейшей работы, которая может вестись параллельно с обеими фракциями.
4. Выделение цитоплазматических РНК (высокополимерной и низкополимерной)
Для выделения цитоплазматических фракций РНК можно использовать около трети полученного водного экстракта, так как этого количества достаточно для измерения удельной активности РНК и входящих в ее состав нуклеотидов. Для дополнительной депротеинизации РНК k водному экстракту добавить равный объем водонасыщенного фенола рН = 6,0, смесь взболтать в течение 15—30 мин и центрифугировать 30 мин при 2600 об/мин. Водную фазу отделить пипеткой и на холоду к ней добавить 1,5—2 объема спирта.
Через 0,5—1,0 час выпавший осадок отделить центрифугированием (15 мин, 3000 об/мин) в больших пробирках. Для лучшего удаления надосадочной жидкости пробирки с осадком перевернуть на фильтровальную бумагу и оставить так на несколько минут, следить, чтобы не сполз осадок. Затем РНК растворить в 5 мл бидистиллята рН = 7,0 при тщательном перемешивании палочкой и перенести в центрифужные пробирки на 10 мл.
К раствору РНК, если нужно осветленному центрифугированием, добавит кристаллический хлористый натрий с таким расчетом, чтобы конечная концентрация хлористого натрия в растворе составляла 2 М (580 мг хлористого натрия на 5 мл раствора РНК). Соль растворить перемешиванием. Пробирки оставить на ночь в холодильнике. В 2 М хлористом натрии выпадает в осадок цитоплазматическая РНК (главным образом с-РНК или акцепторная РНК). Осадок высокополимерной РНК отделить центрифугированием (5000 об/мин 15 мин), надосадочную жидкость слить в чистую центрифужную пробирку.
Низкополимерную РНК осадить из надосадочной жидкости добавлением 2-х объемов спирта на холоду. Через 0,5—1 час осадок низкополимерной РНК отделить центрифугированием (15 мин 3—5 тыс. об/мин). Для лучшей очистки полученных фракций от фенола, продуктов деградации и ДНК, РНК подвергнуть следующим переосаждениям. Выеокополимерную РНК растворить в 3—5 мл бидистиллята (pH = 7) и осадить двумя объемами спирта на холоду. Через час осадок отделить центрифугированием. Цикл переосаждений хлористым натрием-спиртом можно повторить еще один-два раза. При этом нужно следить, чтобы раствор хлористого натрия после соответствующих осаждений РНК и отделения осадка удалялся, как можно более полно. В противном случае РНК плохо растворяется в бидистилляте. Низкополимерную РНК 1—3 раза переосадить спиртом. Все переосаждения удобно проводить одновременно с аналогичной работой с ядерной РНК (см. след. раздел). После осаждения обе фракции цитоплазматической РНК растворить точно в 5 мл. бидистиллята рН = 7,0, раствор осветлить центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин) и хранить для дальнейшей работы в замороженном виде или в виде осадка под спиртом.
5. Выделение ядерной РНК
Ядерный материал, содержащийся в промежуточном слое (см. раздел 3) .может быть использован для выделения ДНК и фракций ядерной РНК. В настоящей работе предлагается провести фракционное выделение ядерной PHK, основанное на преимущественной экстракции фенолом m-PHK (информационной РНК) при температуре 60—65 °С, а РНК-смеси предшественника и истинно рибосомальной РНК при температуре 40-45 оС.
В промежуточном интервале температур экстрагируется смешанная фракция РНК. Промежуточный слой «фепольных ядер» повторно обработать фенолом на холоду для более полной очистки от низкополимерной РНК. Для этого к нему добавить водонасыщенный фенол рН = 6,0 в объеме, равном половине первоначального, и такой же объем 0,14 М раствора хлористого натрия. Затем повторить операции, описанные в разделе 3. Для дальнейшей работы собирать только промежуточный слой. К промежуточному слою «фенольных ядер», помещенному в коническую колбу на 300—500 мл, добавить 40—50 мл смеси водонасыщеиного фенола (рН=6,0)—0,14 М хлористого натрия (1:1). Содержимое колбы энергично встряхнуть и колбу поместить в термостатический аппарат для встряхивания при температуре 45 °С на 15 мин. Затем смесь охладить и центрифугировать 30 мин при 3—5 тыс. об/мин. Водный слой перенести пипеткой в чистую колбу, к нему добавить равный объем охлажденного водонасыщенного фенола (рН = 6,0), смесь взболтать 15 мин на холоду, центрифугировать и вновь отбирать водный слой. Последняя обработка фенолом производится для депротеинизации экстракта рибосомальной РНК.
Промежуточный ядерный слой использовать для аналогичной экстракции фенолом три температуре 50 °С (смешанная фракция) и при температуре 65 °С (м-РНК). В учебных целях можно провести две экстракции—при 45 °С и 65 °С, либо одну экстракцию суммарной ядерной РНК при 60 °С. В последнем случае количество животных, используемых в опыте, следует уменьшить в 2—3 раза.
Оставшийся ядерный материал (промежуточный слой) может быть использован для выделения ДНК. РНК после фенольной депротеинизации осадить из водного слоя добавлением 2 объемов спирта на холоду. Сформировавшийся осадок (через час или более) отделить центрифугированием в больших пробирках (15 мин 3—5 тыс. об/мин). После сливания надосадочного раствора пробирки поставить вверх дном на фильтровальную бумагу для полного удаления жидкости (следить, чтобы не сполз осадок). Затем в пробирки пипеткой добавить 0,5—1,0 мл бидистиллята pH = 7,0 и РНК растворить при осторожном вращении или помешивании. Раствор пастеровской пипеткой количественно перенести в малую центрифужную пробирку с коническим дном. Большую пробирку ополоснуть еще 0,5 мл бидистиллята, который также переносится в малую пробирку. Чтобы очистить полученную РНК от примеси ДНК и сравнительно низкомолекулярных продуктов деградации, произвести переосаждение РНК 2—2,5 М хлористым натрием. Для этого в пробирку с раствором РНК добавить 150 мг кристаллического натрия хлористого на 1 мл раствора, соль растворить и пробирки оставить в холодильнике на ночь. Выпавший осадок отделить центрифугированием (15 мин 6000 об/мин) и переосадить спиртом. Примесь ДНК в солевой надосадочной жидкости можно обнаружить добавлением к ней 2 объемов спирта. Выпадение нитевидного осадка, прилипающего к палочке, указывает на присутствие в первоначальном экстракте ДНК (навивная ДНК растворима в 2 М растворе хлористого натрия, но не растворима в спирте). В случае заметного количества ДНК цикл переосаждений «соль—спирт» нужно повторить еще 1—2 раза. Однако абсолютная очистка РНК от ДНК достигается лишь обработкой ферментом дезокеирибонуклеазой. После последнего осаждения ядерную РНК растворить точно в 3 мл бидистиллята, раствор осветлить центрифугированием (10 мин 3000 об/мин) и хранить в замороженном состоянии.
6. Определение концентрации растворов фракций РНК
В результате проведенной работы должны быть получены следующие фракции РНК:
1. Цитоплазматическая высокополимерная РНК (главным образом р-PHK);
2. Цитоплазматическая низкополимериая РНК (главным образом с-PHK);
3. 1 — фракция ядерной РНК (предшественник и собственно р-РНК);
4. 2— промежуточная фракция ядерной РНК;
5. 3 — фракция ядерной РНК (главным образом m-PHK).
В соответствующее количество пробирок (удобно пользоваться градуированными пробирками) налить 9,9 мл 0,14 М. хлористого натрия для цитоплазматических фракций и 4,9 мл 0,14 М хлористого натрия для ядерных фракций. Микропипеткой в них внести по 0,1 мл соответствующих растворов РНК. Содержимое пробирок тщательно перемешать, затем произвести измерение поглощения ультрафиолета полученными растворами при длине волны 290 и 260 нм на спектрофотометре. В контрольную кювету налить 0,14 М раствор хлористого натрия. Измерения производить в средней части шкалы прибора (Е=0,1—0,8). Если этого сделать не удается, необходимо приготовить новый раствор РНК соответственно большей или меньшей концентрации. (Величину разведения записать). Расчет концентрации РНК в растворах, которые непосредственно поступали на фотометрирование, произвести по следующей формуле:
с=∆260х40,
Где: с – концентрация РНК в γ/мл;
∆260 – разность экстинций при 260 и 290 нм;
40 – эмпирический коэффициент.
Концентрация РНК в исходном растворе рассчитывается с учетом последующих разведений. Например:
Где:
С - концентрация РНК в исходном растворе в γ на мл;
5 – общий объем раствора после разведения, в котором определена концентрация с в γ/мл;
0,1 – количество исходного раствора, взятое для разведения, в данном случае до 5 мл (в мл).
7. Определение удельной радиоактивности полученных фракций РНК
Провести описанным выше способом. (Лабораторная работа 4).
8. Определение нуклеотидного состава и радиоактивности отдельных нуклеотидов. Работу провести по методу, описанному выше (лаб. работа 4).
Полученные результаты внести в следующие таблицы:
Таблица 1. Удельная радтоактивность РНК
№ п/п | Название фракций | Концентрация РНК в готовых растворах «С», в g/мл | Объем, взятый для приготовления препарата, в мл | Количество РНК, мг | Скорость счета в имп/мин | Удельная ативность РНК, имп/мин на 1 мг | Относит. ошибка, % |
Таблица 2. Нуклеотидный состав тотальной ядерной РНК
Фракции ядерной РНК | Нуклео- тиды | Поглощение в УФ соответст. дл. волны | К-во нуклеотидов на 5 мл элюата | Молярные % % | Коэффи- циент специфич- ности Г+Ц/А+У |
Г | |||||
Ц | |||||
А | |||||
У |
Таблица 3. Нуклеотидный состав вновь образованной ядерной РНК
Фракция ядерной РНК | Нуклеотиды | Активность в имп/мин на мкМоль | Ошибка опред., в %% | Молярные %% | Коэффициент специфичности Г+Ц/А+У |
Необходимое оборудование. Центрифуга для больших объемов (3000 об/мин). Центрифуга для малых объемов (до 6000 об/мин). Шюттель-аппарат. Термостатический аппарат для встряхивания. Спектрофотометр. Радиометрическая установка. Аппарат для высоковольтного электрофореза с выпрямителем. Ультрахемископ. рН-метр. Термостат на 37 °С. Холодильник. Весы торзионные или аптекарские. Весы для уравновешивания центрифужных пробирок. Приборчик для получения стандартных осадков. Водоструйный насос. Стеклянный или тефлоновый гомогенизатор.
Посуда. Ванночка для промывания хроматографической бумаги. Эмалированные кюветы. Шприц на 1—2 мл. Шприц на 20 мл с широкой иглой. Зажимы-корнцанги или др. Линейка. Круговой нож для вырезания дисков из фильтровальной бумаги. Скальпели. Штативы для центрифужных пробирок. Груши для пипеток. Широкогорлые банки для животных. Воронки Бюхнера. Колбы Бунзена. Кристаллизаторы для льда. Центрифужные пробирки конические с притертой пробкой на 8 мл. Центрифужные пробирки всех размеров. Градуировнные пробирки на 10 мл с притертой пробкой. Пробирки обычные. Микропипетки на 0,1 и 0,2 мл. Пипетки на 1 – 2 мл. Пастеровские пипетки. Мерные колбы на 100, 50, и 25 мл. Конические колбы на 300 – 500 мл с пробками. Фарфоровые ступки средних размеров. Стеклянные палочки. Аппарат для перегонки фенола. Предметные стекла.
Реактивы и материалы. Радиоактивный фосфор. 0,14 М раствор натрия хлористого. 5 % раствор цитрата натрия (рН=7). Свежеперегнанный фенол с рН = 6. Бидистиллят, доведенный КНСОз до рН = 7,0. Х. ч. кристаллический хлористый натрий. 50 % раствор трихлоруксусной кислоты. 7 % раствор хлорной кислоты. 5 % раствор хлорной кислоты. PHK - носитель (раствор I мг/мл делается перед употреблением). 0,5 н раствор едкий калийя. 5 н раствор едкого калия. 2 М раствор приготовленный из х. ч. уксусной кислоты. Ацетатно – аммонийный буфер pH = 3,5; 0,05-07М (СН3СООН+Н). 1М Фосфатный буфер рН=7,0. Этиловый спирт. Ацетон. Марля. Лед. Листы фильтровальной бумаги. Калька. Плотная бумага. Миллипоровые фильтры 0,45 микрон. Фильтры «синяя лента» Универсальная индикаторная бумага. Хроматографическая бумага (быстрая). Резиновый клей или другой. Мягкий простой карандаш. Карандаши по стеклу разных цветов или маркеры.
Животные. Мыши или крысы
5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Лабораторная работа 6. Определение функционального состояния щитовидной железы IN VITRO по поглощению трийодтиронина, меченного 125j эритроцитами
Метод основан на способности экзогенного трийодтиронина, меченного 125J, включаться в эритроциты исследуемой крови, причем степень включения прямо зависит от функциональной активности железы. Чем больше исследуемого гормона связано с тироксинсвязывающим глобулином, тем меньше свободных мест связывания останется для экзогенного меченого гормона, и последний будет включаться в эритроциты.
Проведение анализа.
1. В пробирку, смоченную гепарином (2 %), вносят 2 мл крови.
2. Добавляют 0,1 мл 125J-трийодтиронина активностью 0,2 мкКи, осторожно перемешивают при 37 °С 45 мин. Во время инкубирования кровь необходимо периодически встряхивать (через каждые 10—15 мин) и выдерживать в термостате строго определенное и всегда постоянное время, так как длительное инкубирование или запаздывание с отмыванием эритроцитов может повысить включение в них 125J-трийодтиронина.
3.Через 45 мин измеряют радиоактивность крови в сцинтилляционном гамма-счетчике.
4. Затем кровь центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин, плазму удаляют, а осадок эритроцитов промывают от невключившейся радиоактивности (3—4 раза) физраствором, объем которого должен превышать в 2—3 раза объем эритроцитов. Центрифугируют содержимое пробирок каждый раз по 5 мин при 1500 об/мин.
5. Отмытые от плазмы эритроциты снова радиометрируют на гамма-счетчике. Рассчитывают процент поглощения эритроцитами трийодтиронина (ПЭТ) по формуле:
Где:
А — радиоактивность отмытых эритроцитов, имп/мин;
В — радиоактивность цельной крови, имп/мин;
Н — гематокрит исследуемого животного.
Гематокрит (процентное содержание форменных элементов крови) определяют в специальных капиллярах центрифугированием в течение 4 мин на гематокритной центрифуге. Поскольку определение гематокрита усложняет методику, многие исследователи считают необязательным учитывать поправку на гематокрит, так как при заболеваниях щитовидной железы он относительно стабилен.
Тест ПЭТ прост в выполнении, является достаточно точным критерием функционального состояния щитовидной железы, позволяет следить за динамикой тиреотоксикоза и судить об эффективности его лечения. Диагностическая точность методики при тиреотоксикозах 91,35 %.
Однако при оценке функции щитовидной железы по ПЭТ могут воз-никать ошибки, обусловленные гемолизом эритроцитов, снижением связывающей способности их при длительном хранении крови. Меченый трийодтиронин следует использовать не более 3—4 недель при хранении в условиях пониженной температуры.
Известно, что при нормальном функционировании щитовидной железы у людей включение 125J-трийодтиронина в эритроциты колеблется в пределах 10-17 %, при гиперфункции 16-34 %, а при гипофункции 5-11 %.
6. ПРИМЕНЕНИЕ РАДИОНУКЛИДОВ В ГИСТОАВТО-РАДИОГРАФИИ
Лабораторная работа 7. Изучение авторадиограмм мазков крови и срезов тканей животных и определение локализации радионуклида в клетках.
Авторадиографический метод позволяет решать ряд вопросов при исследовании обмена веществ на клеточном уровне. Основана авторадиография на получении отпечатка на фотопластинках или слое фотоэмульсии в местах локализации приложенного к этому фотоматериалу слоя биологического или другого материала, содержащего радионуклиды. Их излучение воздействует на зерна бромистого серебра, которые при последующем проявлении образуют картину распределения радионуклидов или меченных радионуклидами соединений.
Наилучшие автографы можно получить при использовании альфа-излучателей. Пробег альфа-частиц в фотоматериалах мал, а плотность ионизации наибольшая. Однако альфаизлучателей, которыми можно метить биологические соединения, нет. Поэтому, для авторадиографии применяют радионуклиды, излучающие бета-частицы. Наиболее широко используют нуклиды, излучающие бета-частицы низкой энергии: сера-35, углерод-14 и тритий в количестве 20—40 МБк на 1 г массы животного. Эти нуклиды вызывают на пути следования в фотоматериалах более плотную ионизацию, поэтому и более отчетливый, а при использовании трития — даже точечный след.
Сроки убоя животных после введения радионуклидов зависят от скорости всасывания и отложения радионуклидов в тканях. Всасывание 3Н-тимидина при внутрибрюшинном введении мышам в объеме 0,25 мл завершается в течение 15—20 мин. Что же касается других нуклидов, например используемых для изучения минерального обмена или обмена микроэлементов, то практически уже через сутки процесс их депонирования в тканях завершается. Поэтому в экспериментах животных можно забивать через сутки после введения радионуклидов. При работе с некоторыми мечеными соединениями, особенно с 3Н-тимидином, необходимо иметь в виду возможность их реутилизации. Однако если животных забивают в первые три дня после введения тимидина, то процесс реутилизации можно не учитывать.
Изготовление гистологических срезов тканей. Для получения высокой разрешающей способности при авторадиографии делают достаточно тонкие срезы органов и тканей, структуры которых содержат радиоактивную метку. Чем тоньше срез, тем точнее может быть определена в структурах клетки локализация меченых соединений или радионуклидов. В этом отношении удобнее работать с кровью и костным мозгом: весь процесс изготовления из них материала для исследований ограничивается нанесением на хорошо обезжиренные предметные стекла тонких мазков крови или костного мозга с последующей сушкой в течение 5 мин.
Приготовление гистологических срезов органов и тканей общепринятым методом требует значительного времени и труда.
Фотоматериалы. Для авторадиографии применяют специальные фотопластинки и жидкие фотоэмульсии. Основное преимущество фотопластинок перед фотоэмульсиями состоит в том, что они имеют слой фоточувствительного материала довольно равномерной толщины. Однако на фотопластинки трудно монтировать срезы тканей в условиях слабого освещения фотолаборатории. Кроме того, толщина светочувствительного материала на пластинках больше, чем толщина слоя, который получается при нанесении фотоэмульсии на приклеенный к предметному стеклу срез ткани.
Для авторадиографии альфа-излучающих радионуклидов используют фотопластинки А 2, для бета-частиц — фотопластинки типа МР и МК (Московский завод технических пластинок). Чаще применяют жидкие фотоэмульсии Р-НИКФИ, М-НИКФИ, ПР-9 и ПР-2. Последние две эмульсии можно хранить в холодильнике в течение нескольких месяцев. Фотоэмульсия ПР-9 обладает более мелким зерном, чем эмульсия ПР-2, и пригодна для использования в электронной авторадиографии.
Методы нанесения фотоэмульсии на препараты. Фотоэмульсию наносят на предметные стекла со срезами тканей путем погружения их в стаканчик с расплавленной эмульсией (со стороны, свободной от среза, эмульсию удаляют) или посредством нанесения ее на предметные стекла в определенном количестве. Перед использованием эмульсию расплавляют в ультратермостате при температуре 40—42 °С. После этого разбавляют эмульсию смесью дистиллированной воды с глицерином (99 мл дистиллированной воды + 1 мл глицерина) в соотношении 1: 6. Разведенную эмульсию нагревают в течение часа при 40—42 °С, осторожно помешивая палочкой. После этого в эмульсию погружают предметное стекло, вынимают его, протирают одну сторону марлей и рассматривают слой эмульсии при зеленом свете. Если на стекле нет непрозрачных комочков и неравномерного распределения эмульсии, то она готова к употреблению. В противном случае продолжают нагревание и помешивание до готовности.
Экспозиция препаратов. При авторадиографии экспозиция для радионуклида подбирается в зависимости от его удельной активности и периода полураспада. Для короткоживущих радионуклидов экспозиция более трех периодов полураспада нецелесообразна. Чем больше удельная активность среза ткани, тем меньше должна быть экспозиция. Время экспозиции можно определить эмпирически. Для этого делают по три дубликата каждого препарата и проявляют их через различные сроки после начала экспозиции, например через 1, 2 или 4 недели. Экспозиция может значительно варьировать, но она должна быть одинаковой для всей серии опытов.
Необходимо учитывать, что при очень продолжительной экспозиции на автографах образуется вуаль.
Проявление радиоавтографов. За сутки до проявления радиоавтографов готовят проявитель. Время проявления 30 мин при температуре 18 °С. Для фотообработки радиоавтографов удобно использовать 4 специальных сосуда, вмещающих одновременно по 20 предметных стекол. В первый сосуд наливают проявитель (метол — 1 г, Na2SO4 кристаллический — 75, гидрохинон — 4, Na2SO3 кристаллический — 55, KBr — 2,5 г, дистиллированная вода — 1 л), во второй — останавливающий раствор (5 % раствор уксусной кислоты), в который после промывания помещают на 1 мин радиоавтографы, в третьем сосуде промывают автографы водой в течение 30 с. Закрепление осуществляют в четвертом сосуде 20 % раствором гипосульфита до просветления фотоэмульсии (примерно 5—8 мин). После фиксирования автографы промывают в проточной воде 30 мин.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
