Использование радионуклидов для изучения обмена веществ в организме животных (стр. 1 )

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ

ФГОУ ВПО «МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ

им. К. И. СКРЯБИНА»

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАДИОНУКЛИДОВ

ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ

В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ

Учебное пособие

Допущено Учебно-методическим объединением высших

учебных заведений Российской Федерации по образованию в области

ветеринарии и зоотехнии в качестве учебного пособия для студентов

высших учебных заведений, обучающихся по специальности

«Ветеринария» и «Зоотехния»

Москва - 2008

УДК 619:.

. – Использование радионуклидов для изучения обмена веществ в организме животных. - Учебное пособие. - М.:ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2008, 44 с.

Предназначено для студентов факультетов: ветеринарно-биологического, ветеринарной медицины, зоотехнологий и агробизнеса

Изложены принципиальные основы радиоиндикаторного метода, сжато и вместе с тем доступно даны необходимые сведения из области радиометрии, организации и проведения работ с радиоактивными индикаторами. Подобраны эксперименты, выполнение которых с достаточной полнотой знакомит студентов с практическим применением радионуклидов для изучения основных видов обмена веществ – минерального, белкового и нуклеинового.

Рецензенты: доктор биологических наук, засл. деятель науки РФ,

профессор , доктор химических и биологических наук, профессор , доктор биологических наук, профессор

1. ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ РАБОТ

С РАДИОАКТИВНЫМИИНДИКАТОРАМИ

Радионуклидный метод в современной науке служит одним из главных инструментов научного познания. Ему обязаны многие важнейшие достижения биологии, медицины и сельского хозяйства. В данном учебном пособии изложены принципиальные основы радионуклидного метода. Большое внимание уделено вопросам подготовки проб радиоактивного материала для радиометрии, а также планированию радиоиндикаторных экспериментов. В первой части сжато и вместе с тем доступно для биологов изложены основные способы расчета активности радионуклидов так как при работе с радионуклидами необходимо учитывать изменение их активности со временем. Поэтому в первой лабораторной работе подробно изложены методы расчета активности и предлагается решить ряд задач, которые помогут получить первые навыки работы с радиоактивными веществами.

Во второй части подобраны эксперименты, выполнение которых с достаточной полнотой знакомит студентов с практическим применением радионуклидов для изучения основных видов обмена веществ в организме животных – минерального, белкового и нуклеинового.

Учитывая особую важность организационных мероприятий при работе с радиоактивными веществами ниже приведены основные этапы организации и проведения работ. В целях приобретения практических навыков работы с радионуклидами следует выполнить ряд лабораторных работ, приведенных ниже.

Лабораторная работа 1. Методы расчета активности и приготовление рабочих растворов радионуклидов.

Цель занятия – освоить методы расчета активности (количества) радионуклидов на заданное время и поправки на радиоактивный распад, а также приобрести практические навыки работы с открытыми радиоактивными веществами.

При работе с радиоактивными веществами необходимо учитывать изменение активности их излучения со временем. Для этого нужно вводить поправку на радиоактивный распад. Учет поправки позволяет дозировать количество изотопа, подлежащего введению в исследуемую систему.

Часто бывает нужно иметь суждение о теоретически ожидаемой активности данного препарата в данный момент с тем, чтобы исключить влияние распада, подметить специфику перераспределения изотопа, изменение интенсивности обмена и т. д.

Иногда с большим трудом решается вопрос о том, надо или не надо вносить поправку на радиоактивный распад для данного изотопа, обладающего периодом полураспада, соизмеримым с длительностью эксперимента, и если надо, то какую именно.

Правильное и быстрое производство расчетов, необходимых для решения этих задач, связано в первую очередь с быстрым вычислением величины поправочного коэффициента на радиоактивный распад.

Обычно в литературе приводится уравнение радиоактивного распада и значение константы распада: Nt = No•e-λt. λ = 0,693/T, где T – период полураспада.

Исходя из этих двух уравнений, каждому представляется возможность самому определить величину поправочного коэффициента на радиоактивный распад.

Можно видеть, что вычисление величины поправки, равной - e-λt является довольно сложным, так как связано с производством ряда математических действий.

Существующие методы (метод Хевеши по изотопам фосфора, натрия, калия, активность которых им принята как исходной, равной 10.000 имп/мин, по радону, активность излучения которого исчисляется по истечении каждого часа и принимается равной единице) очень громоздки.

предлагает новый метод вычисления поправочного коэффициента на радиоактивный распад.

Этот метод является универсальным, так как позволяет вычислить значения поправок для всех радиоактивных изотопов, обладающих различными периодами полураспада.

При разработке метода использовано универсальное уравнение радиоактивных превращений: Nt=No•e-λt,/1/

где Nt – число атомов простого радиоактивного вещества в момент времени t; No – исходное число атомов простого радиоактивного вещества в момент времени t = 0(No > Nt); е-основание натуральных логарифмов; λ–постоянная распада данного изотопа; t–время.

Суть предложенного метода заключается в том, что при расчетах поправочного коэффициента К на радиоактивный распад она выражает время t в долях периода полураспада Т, т. е. по существу определяется значение К= 0,693•t/T, где отношение t к Т [t/Т] является отвлеченным числом, не зависящим от того, в каких единицах измеряется время (при нахождении величины отношения t/Т, конечно, t и Т должны выражаться в одних единицах измерения времени – секундах, минутах, днях, годах).

Значения коэффициента К, вычисленные для различных значений времени t, являются универсальными, т. е. применимыми ко всем радиоактивным изотопам.

Для того чтобы рассчитать активность на заданное время необходимо начальную активность (No) разделить на поправочный коэффициент (К): Nt = No/К;

Для того, чтобы определить сколько было радионуклида, нужно имеющуюся активность умножить на коэффициент К: Nt = No•К.

Значения поправочного коэффициента (К) на радиоактивный распад для различных значений времени (t) выраженного в долях периода полураспада (t/Т), находят по таблице.

Для приобретения практических навыков расчета активности, вычисления поправочного коэффициента на радиоактивный распад и приготовления рабочих растворов радионуклидов предлагается выполнить ряд упражнений.

Упражнение 1. Решить несколько задач разных типов, связанных с учетом явления радиоактивного распада.

Типовая задача №1

Найти поправку на радиоактивный распад К, если от начала опыта прошло время t.

Пример. Имеем препарат радиоактивного натрия (Т = 14,8 часов). Какую оправку надо внести по истечении 4 часов?

Решение. Определим, какую часть периода полураспада составляет 4 часа?

t/T = 4:14,3 = 0,27 (периода полураспада).

По таблице находим значение поправки К, соответствующее времени t = 0,27 периода полураспада. Она равна 1,20.

Типовая задача №2.

Найти активность излучения препарата (NТ) через интервал времени Т, если его исходная активность была No.

Пример. Предложим, что мы имеем препарат радиоактивного Вr86 (Т = 34ч). Исходная активность излучения препарата (No), была равна 1200 имп/мин. Требуется найти его активность через 26 часов.

Решение. Выражаем время t = 26 часами в долях периода полураспада t/T 26:34 = 0,76 (периода полураспада).

По таблице находим поправку на радиоактивный распад К. Она равна 1,69. Рассуждаем следующим образом. Исходная активность (No) была равна 1200 имп/мин., а к моменту времени t = 26 часам = 0,76 периода полураспада, т. е. уменьшилась в 1,69 раза. Следовательно, No/Nt=1,69; откуда Nt = No = 710 имп/мин.

Итак, искомая активность Nt = 710 имп/мин.

Типовая задача №3.

Определить исходную активность излучения радиоактивного изотопа (No) необходимую для постановки длительного эксперимента.

Пример. Какую исходную активность (No) препарата радиоактивного фосфора надо взять (Т = 14, 3 дня) с тем, чтобы через 56 дней (время t) иметь активность этого препарата, равную 75 имп/мин.

Решение. Время t = 1 месяц 26 дней = 56 дней.

Какому числу периодов полураспада (Т) это соответствует? 56:14,3 = 3,92 (периода полураспада).

По таблице находим соответствующее значение поправки К. Она равна 14,88. Следовательно, для того чтобы наблюдать желаемую активность Nt = 75 имп/мин через интервал времени t = 3,92 периода полураспада, мы должны ввести в объект следующую исходную активность: No/ Nt = К, откуда No=Nt•К = 75•14,88 = 1116 имп/мин.

Итак, исходная активность No = 1116 имп/мин ≈ 1100 имп/мин.

Типовая задача №4.

Определить время t, по истечении которого надо вносить поправку на радиоактивный распад данного изотопа.

Прежде всего определим для себя точность, с которой мы хотим работать. Если при работе будут учитываться интервалы времени Δt = 0,01 Т, то точность, с которой будут производиться вычисления поправочного коэффициента К, будет не больше 0,7% (при t = 0,01 Т, коэффициент К, равен = 1,007).

Если будут учитываться интервалы времени Δt = 0,05 Т, то точность, с которой будут производиться вычисления поправочного коэффициента К будет не больше 3% (при t = 0,05 Т, коэффициент К = 1,03).

И наконец, если будут учитываться интервалы времени Δt = 0,1 Т, то точность, с которой будут производиться вычисления поправочного коэффициента, будет не больше 7% (при t = 0,1 Т, коэффициент К = 1,07).

Упражнение 2. Рассчитать радиоактивность на заданное время пользуясь уравнением закона радиоактивного распада Nt = No * e-0,693*t/T, а также по методу предложенному

Задача 1.

На 15 декабря 2004 г. исходная активность (No) радионуклида фосфора–32 была равна 40 МБк/мл. Определить радиоактивность (Nt) фосфора–32 на 25 декабря 2004 г. Период полураспада (Т) фосфора – 32 = 14,3 дня.

Задача 2.

Радиоактивность йода – 131 на сегодняшний день (No) составляет 400 МБк/мл. Определить активность этого радионуклида (Nt) через 8, 16 и 80 суток. Период полураспада йода–131 = 8,1 дня.

Задача 3.

Мясо крупного рогатого скота имеет удельную активность (No) на 1 мая 2001 г. 1000 Бк/кг (по цезию –137). Какова активность мяса (Nt) будет 1 мая 2005 г. и 2010 г. Период полураспада (Т) для цезия–137 = 28 лет.

Задача 4.

Грубые корма загрязнены радиоактивными стронцием–90 и цезием–137. Удельная активность (No) стронция–90 = 5000 Бк/кг, цезия–137 = 2500 Бк/кг. Определить какова активность кормов (Nt) будет через 10 мес., 2 года и 5 лет. Период полураспада стронция-90 = 28 лет, цезия–137 = 37 лет. Можно ли будет скармливать эти корма мясному и молочному скоту и в каком количестве (ДУ загрязнения грубых кормов (сено, солома) по стронцию–90 = 180 Бк/кг, по цезию–137 = 250 Бк/кг).

Задача 5.

Овечья шерсть имеет удельную активность (No) 25 МБк/кг (радионуклид сера–35). Рассчитать какая удельная активность шерсти была 120 и 230 суток тому назад и какая будет через 60 и 500 дней. Период полураспада серы–35 = 87,1 сут.

Задача 6.

При закладке силоса трава была загрязнена радиоактивным йодом–131 (Т = 8,1 дня) в количестве 37000 Бк/кг. Рассчитать какова удельная активность силоса будет через 25, 45 и 80 суток.

Задача 7.

Ягель загрязнен полонием–210 в количестве Бк/кг (Т = 138,3 дня). Определить удельную активность ягеля через 75, 150 и 1200 суток.

Задача 8.

Для радиоиммунного анализа получен гормон щитовидной железы тироксин меченный радионуклидом йод–125 (Т = 60 суток) активностью 8 МБк/мл (No). Рассчитать удельную радиоактивность через 30, 90 и 300 суток.

Задача 9.

Комбикорм загрязнен цезием–144 (Т = 282 дня). Удельная активность равна 3000 Бк/кг. Рассчитать какая удельная активность комбикорма была 140 дней тому назад и какая будет через 50, 170 и 850 суток.

Задача 10.

Молоко загрязнено радионуклидом йод–131 (Т = 8,1 сут.). Удельная активность равна 1500 Бк/л. Рассчитать удельную активность молока через 12 часов, 8, 24 и 60 суток и можно ли использовать его в пищу людям, если ВДУ для молока равен 375 Бк/л.

Задача 11.

Сгущенное молоко загрязнено радиоактивным стронцием–90 (Т = 28 лет) и цезием–137 (Т = 30 лет). Удельная активность равна 20000 Бк/кг. Определить удельную радиоактивность сгущенного молока через 12 мес, 1 и 4 года.

Приготовление растворов радионуклидов. Радионуклиды поставляют обычно в виде растворов или порошков с высокой удельной активностью, и перед работой их необходимо разбавлять: если радионуклиды поставляют в растворах кислот, то для их разбавления пользуются кислотами примерно той же нормальности, какая указана в паспорте радионуклида. Для удобства расчета разбавление проводят до такого объема, чтобы активность 1 мл раствора составляла 37 МБк. Разбавленные растворы радион6уклидов хранят в пробирках объемом 5-10 мл плотно закрытых резиновыми пробками. Радионуклиды, поставляемые в виде порошков, растворяют в зависимости от их химических свойств в концентрированных или разбавленных кислотах. Концентрированные кислоты обычно используют для растворения окисей элементов. Радионуклиды, находящиеся в виде солей, растворяют в разведенных кислотах. Для этой цели применяют те кислоты, солями которых являются данные нуклиды. Порошки растворяют непосредственно в пробирках, в которых они поставляются, а затем полученный раствор переносят в пробирки большего объема.

Способы введения радионуклидов в организм животных. Пути введения радионуклидов в организм зависят от конкретных задач эксперимента. Мышам радионуклиды вводят подкожно, но чаще внутрибрюшинно (последний путь по скорости всасывания приближается к внутривенному), кроликам и крысам можно вводить внутрибрюшинно, подкожно или внутривенно (кроликам в ушную вену, крысам в хвостовую).

Необходимое количество радионуклида для введения мелким животным должно быть в объеме от 0,2 до 1 мл. Перед введением радионуклидов в организм животных следует проверять рН полученного раствора индикаторной бумагой. При очень кислой реакции перед введением раствор нужно нейтрализовать 1—2 каплями 20 % раствора гидроксида натрия до рН 5—6.

Упражнение 3. Приготовить 10 мл рабочего раствора радионуклида 14С (гидролизат белка) и определить эффективность счета радиометрической установки для данного радионуклида.

Материалы и оборудование: Радионуклид 14С (гидролизат белка), колбочки на 50 мл – 2 шт., микропипетки на 1 – 100 мкл – 2 шт., чашки Пэтри – 10 шт., пинцеты – 10 шт., мишени из фольги – 30 шт., фильтровальная бумага, резиновые перчатки, пакеты для отходов, салфетки для рук, радиометры.

Порядок работы.

1.  Ознакомиться с сертификатом на радионуклид (меченое соединение) и записать в рабочую тетрадь основные сведения: номер сертификата, номер контейнера, удельную и общую активность радионуклида, объем раствора, наличие примесей и др.

2.  Рассчитать удельную и общую активность радионуклида на день опыта исходя из данных сертификата (см. упр. 1).

3.  Рассчитать во сколько раз надо разбавить исходный раствор радионуклида, чтобы получить рабочий раствор с активностью Бк/мл.

4.  Внести в стеклянную колбочку необходимое количество раствора-разбавителя (чаще физраствор), а затем туда же микропипеткой необходимый объем исходного раствора радионуклида, перемешать.

5.  Для определения эффективности счета приготовить из рабочего раствора эталонные счетные образцы. Для этого в стеклянную колбочку внести 9 мл дистиллированной воды и 1 мл рабочего раствора радионуклида. Получим раствор с активностьюБк/мл.

6.  Из приготовленного раствора нанести на мишени из фольги по 0,1 и 0,2 мл, равномерно распределить по площади мишени и определить скорость счета сырого образца, затем высушить и снова определить скорость счета. Время счета определить по таблице Бэлла с ошибкой 5 %.

7.  Рассчитать эффективность счета радиометрической установки.

8.  Рассчитать какое количество радионуклида надо ввести животному массой 20 г из расчета 3700 Бк/г массы и в каком объеме рабочего раствора содержится это количество.

Приготовление проб биологического материала для радиометрии. В качестве проб для исследования с применением радионуклидов используют кровь, мочу, воду, молоко, ткани животных, выделенные из тканей белки, нуклеиновые кислоты, липиды и т. д. В большинстве случаев такие пробы нельзя считать непосредственно, их необходимо превратить в более удобную для счета форму. Выбор формы пробы для счета зависит от нескольких связанных между собой факторов. Если проба твердая, то ее нужно распределить равномерно и воспроизводимым способом, что особенно важно для альфа - или бета - излучающих радионуклидов с низкой энергией. При содержании в крови или моче бета - излучателя низкой энергии необходимо учитывать самопоглощение, из-за которого снижается эффективность счета и получается плохая воспроизводимость. Это обычно требует превращения проб в стандартную и наиболее подходящую для счета форму. Биологические пробы, содержащие гамма - излучающие радионуклиды, можно измерять непосредственно только после минимальной предварительной обработки. Оптимальную форму пробы для счета определяет тип счетчика. Предварительная обработка биологических проб для последующего измерения радиоактивности заключается в уменьшении объема материала и получении его в гомогенном виде.

В зависимости от метода анализа иногда нужно пробу перевести в более удобное физическое состояние, нередко выделяют соединение из большого объема материала (ткань, кал, кровь и т. д.). Наиболее практичный метод концентрирования радионуклида — озоление пробы (сухое или мокрое). Большинство методов мокрого озоления представляют вариации хорошо известного метода Къельдаля. Успешно используют для сжигания различ­ные комбинации азотной, серной, соляной и хлорной кислот. Ткани в гомогенный раствор превращают с помощью формамида или гиамина.

Расчет количества радионуклида для введения подопытному животному. Количество радиоактивного нуклида определяется задачей эксперимента, но оно должно быть по возможности меньшим, чтобы не вызвать побочных лучевых воздействий на организм подопытного животного и вместе с тем обеспечить достоверную регистрацию радиоактивного вещества в исследуемом органе или ткани. В этом случае скорость счета от препарата должна превышать скорость счета фона минимум в 2 раза. Так, если уровень фона при работе со счетчиком МСТ-17 составляет приблизительно 25 имп/мин и для радиометрии будут приготовлены препараты массой 100 мг из органов подопытного животного (например, мыши массой 20 г), то скорость счета от такого препарата не должна быть менее 50 имп/мин, или 0,5 имп. от 1 мг навески. Следовательно, мыши массой 20 г мг) при условии равномерного распределения радионуклида в организме необходимо ввести радиоактивный препарат из расчета скорости счета от всей мыши 10000 имп/мин. Но поскольку можно предполагать, что фосфор распределяется в организме животного неравномерно, то количество вводимого радионуклида для исследования его в некоторых (не тропных) тканях следует увеличить примерно в 3 раза. Тогда в нашем случае мыши массой 20 г необходимо ввести 10000-3 = 30000 имп/мин. Вместе с тем при исследовании органов и тканей, избирательно накапливающих радиоактивное вещество, количество вводимого радионуклида можно уменьшить.

Далее следует учесть эффективность счета. Известно, что для счетчиков МСТ-17 она равна в среднем 20 %. Это заставляет увеличить количество вводимого мыши радионуклида еще в 5 раз, то есть имп/мин.

Индикаторное количество радионуклида зависит от степени резорбции его в ЖКТ, скорости выведения, избирательности накопления в органах и тканях, от вида и энергии излучения, периода полураспада, от чувствительности регистрирующей аппаратуры. Все же, несмотря на эти многочисленные факторы, опреде­ляющие количество радионуклида, в острых опытах, продолжающихся не более недели, для большинства радионуклидов достаточна активность 1 МБк на 1 кг массы животного.

Приготовление рабочего раствора радионуклида и введение его подопытным животным. Для приготовления рабочего раствора следует определить массу животного, а также количество радионуклида, которое нужно ввести одному животному. При установлении радиоактивности 1 мл имеющегося раствора радионуклида (исходя из данных сертификата на Радионуклид, см. выше) разведение делают с таким расчетом, чтобы необходимая активность для введения одному животному равнялась 0,2—1 мл раствора. Исходный радиоактивный раствор разводят до необходимой концентрации на кювете, покрытой фильтровальной бумагой, под тягой в специальном защищенном боксе или за экраном из оргстекла с помощью механических пипеток (пипетка с грушей). Раствор радионуклида чаще вводят внутрибрюшинно. Мышей и крыс помещают в широкогорлые стеклянные банки, а крупных животных содержат в отдельном специально оборудованном помещении.

Подготовка рабочего места. Стол и специальную кювету с защитным экраном из оргстекла покрывают фильтровальной бумагой. На кювету поставить препаровальную ванночку (можно чашку Петри) и маленький кюветик (также чашку Петри) для сбрасывания отходов (кювету также застилают бумагой). На большую кювету положить ножницы большие и глазные, два скальпеля, два анатомических пинцета, пинцет Кохера. На отдельную кювету поместить торзионные весы и пинцет для работы с ними. Нарезать кусочки кальки для взвешивания ткани, мишени-подложки для радиометрии биологических препаратов приготовить площадью 2 см2 из алюминиевой фольги с помощью специального штампа. Для взятия проб крови вырезать из фильтровальной бумаги диски такого же размера, как мишени-подложки из фольги.

2. РАДИОНУКЛИДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МИНЕРАЛЬНОГО ОБМЕНА У ЖИВОТНЫХ

Интенсивность обмена минеральных веществ в организме сельскохозяйственных животных исключительно высока. В практике животноводства при недостаточном или неправильном минеральном питании и вследствие нарушения минерального обмена нередко встречаются случаи заболевания животных рахитом, остеомаляцией и т. д.

В настоящей лабораторной работе предлагается выполнить несколько упражнений, которые дают практические навыки использования радионуклидов для изучения минерального обмена у животных. Одной из часто встречающихся задач являются изучение усвоения из кормов фосфора, кальция и минеральных подкормок, исследование динамики накопления, характера распределения и перераспределения минеральных веществ в организме и их выделение из организма с мочой и фекалиями, выдыхаемым воздухом и т. д.

Лабораторная работа 2. Исследование характера распределения, миграции, накопления и выведения фосфора в организме животных.

Для выполнения данного упражнения отбирают подопытных животных (крыс или мышей), вводят подкожно или внутрибрюшинно соединения, содержащие фосфор-32 (чаще Na2H32PO4). Через различные промежутки времени после введения радионуклида проверяют радиоактивность мочи и кала, затем животных убивают и исследуют различные органы на содержание радиоактивного фосфора с помощью радиометрических методов.

Данная работа описывается нами весьма подробно потому, что основные приемы работы с радионуклидами остаются неизменными при проведении большинства опытов.

Материалы и оборудование: радионуклид 32Р, подопытные животные, бачок для отходов, шприцы на 1 мл, пипетки на 0,1 и 5 мл, пинцет Пеана, скальпель, ножницы, пинцет анатомический, кювета, защитный экран из оргстекла, банки или клетки для содержания животных, весы, спецодежда (фартук, нарукавники, перчатки), чашки Петри, мишени из фольги, гомо­генизатор стеклянный, пробирки стеклянные, эфир, вата, бумага фильтро­вальная.

Получение гомогената, приготовление препаратов для радиометрии и проведение заключительных мероприятий. Перед нача­лом занятий включить муфельную печь, чтобы она успела достаточно нагреться к тому моменту, когда надо будет прокаливать кость. Установить температуру порядка 300 °С.

Через 1—2 ч после введения нуклида мышь убить декапитированием. Кровью каждого животного пропитать 2—3 взвешенных диска из фильтровальной бумаги, которые поместить на предварительно взвешенные мишени из фольги. Разница между массой мишени вместе с диском из бумаги и массой мишени с кровью составит навеску крови. Можно кровь отбирать микропипеткой.(0,1 мл) и пропитывать ею бумажный диск, в этом случае не нужно взвешивать препараты, а результаты выражать на объем крови. После взятия крови мышь поместить в препаровальную ванночку (чашку Петри) и вскрыть. Радиоактивность фосфора-32 определить в крови, печени, мозге, костях и легких. От каждого органа брать две параллельные пробы.

Навески ткани 200—300 мг (или более) гомогенизировать в дистиллированной воде в соотношении 1 : 4, гомогенат наносить пипеткой на мишень в объеме 0,2—0,4 мл. Масса препарата мозга обычно меньше 100 мг, поэтому приходится ограничиваться изготовлением одного препарата без параллельной пробы. Если в лаборатории нет условий для проведения гомогенизации ткани, можно навески 200 мг поместить на мишени из фольги, измельчить их до кашицеобразной консистенции, распределить по всей площади мишени.

Кости конечностей очистить от мышц, взвесить и поместить в фарфоровых тиглях в муфельную печь на 1—2 ч. Прокаленные кости измельчить в тигле при помощи стеклянных палочек и перенести на мишени из фольги.

Мишени из фольги с приготовленными препаратами поместить на стандартные алюминиевые подставки или приклеить на предметные стекла, а затем перенести в радиометрическую комнату. Если радиометрия и препаративная работа ведутся в одной и той же комнате, то перед началом счета из помещения удаляют радиоактивные отходы.

Тушки животных и другие отходы положить в специальные пластиковые мешки и держать в холодной комнате. Трупы животных можно класть в закрывающиеся ванны и заливать форма­лином или спиртом-сырцом. В таком виде отходы сохраняются до вывоза в места захоронения или до полного распада радионуклида. После инактивации радионуклида радиоактивные отходы утилизируют как обычные отходы. Препаровальные инструменты, шприцы и другие загрязненные предметы помещают в стеклянных сосудах в ванну для мойки радиоактивной посуды под проточную воду на несколько часов (для снижения уровня радиоактивности).

После окончания работы инструменты вынуть из воды, осушить фильтровальной бумагой и проверить их чистоту при помощи лабораторного переносного радиометра. Таким же способом проверить чистоту перчаток и рук. В случае необходимости перчатки и руки вымыть водой или моющими средствами, высушить фильтровальной бумагой и снова проверить чистоту радиометрами СЗБ-04, РУП-1 КРБ-1 и др. В заключение проверить чистоту рабочих мест, полов и т. д.

Радиометрия препаратов. Подготовить к работе радиометрическую установку, определить время счета фона и препарата с точностью до 5 %. Для этого устанавливают скорость счета фона и скорость счета препарата с фоном за 1 мин. Измерения проводят в одинаковых геометрических условиях. При помощи таблицы Белла (см. приложение 2) находят время счета препарата и фона. Однако если для достижения 5 % точности потребуется более 10 мин, ограничиваются 10-минутным счетом, оговаривая это в записи результатов. Результаты измерения занести в таблицу и для удобства сравнения сделать пересчет на одинаковую навеску, например 100 мг или 1 г сырой ткани. Если точно известна эффективность счета, то можно рассчитать истинную активность всех препаратов. Тогда для записи истинной активности в таблицу вводят дополнительную графу. Форма записи результатов представлена ниже (табл.1)

Таблица 1

Результаты радиометрии препаратов

Препарат	Масса препарата, мг	Скорость счета, имп.	Удельная активность
За 1 мин	За 1 мин без фона	Расп/мин	Расп/мин/г или мг

Печень-1

Печень-2

Кровь-1

Кровь-2 и т. д.

При наличии времени на занятии эту работу можно поставить более широко, проследить в органах и тканях животного динамику фосфора при недостатке его в рационе.

Упражнение 1. Исследование обмена кальция в скелете животных.

Для определения скорости обмена кальция в скелете применяют самые разнообразные методы с использованием радионуклидов. Изучают динамику выделения радиоактивного кальция с экскрементами после однократной инъекции радионуклида и по этим данным устанавливают биологический период полуобновления кальция в скелете (без убоя животных). Время обновления кальция в скелете можно рассчитать на основании определения содержания радиоактивного кальция в скелете нескольких групп животных, забитых в разные сроки, после однократного введения радионуклида всем животным.

В настоящем упражнении предлагается выполнить эксперимент по изучению удельной радиоактивности различных участков скелета в разные сроки после однократного введения им радиоактивного кальция-45.

Материалы и оборудование: подопытные животные (крысы или мыши), радионуклид 45Са, кювета с защитным экраном, скальпели, ножницы, пин­цеты, банки или клетки для содержания животных, спецодежда (фартук, нарукавники, перчатки), чашки Петри, бачок для отходов, шприц на 1 мл с иглой, пипетки на 1 и 5 мл, колбы на 100 мл, муфельная печь, фарфоровые тигли, мишени из фольги.

Необходимо приготовить рабочий раствор радионуклида (кальций-45) и ввести его подопытным животным. Крысам вводят препарат в виде хлористого кальция. Расчет активности на день опыта и количество радионуклида для введения животным, приготовление рабочего раствора проводят способом, описанным в упражнении 1.

Раствор вводят внутрибрюшинно в объеме 1 мл. Время экспозиции 1, 2, 5 ч, а при возможности и несколько суток.

Приготовление препаратов для определения радиоактивности. По прошествии определенного времени с момента введения ра­дионуклида животных дезактивируют. Кости из различных участков скелета очистить от мышц, взвесить и поместить в фарфоровых тиглях в муфельную печь на 1—2 ч при 400—500 °С. Прока­ленные кости измельчить в тигле при помощи стеклянных палочек, перенести на мишени из фольги.

Радиометрия препаратов и выражение результатов. Радиометрию препаратов проводят с точностью до 5 % тем же способом, что и в упражнении 1. Для удобства сравнения результаты вы­ражают в имп/мин/г сырой кости. Если точно известна эффективность счета, то можно рассчитать истинную активность всех препаратов. Для записи результатов можно использовать форму в указанную в лаб. работе 1.

Упражнение 2. Исследование распределения фосфора в фосфорсодержащих соединениях печени крыс.

В работе определяют, какую часть печени составляет кислоторастворимый фосфор, фосфор липидов, фосфор нуклеиновых кислот и какая часть фосфора сохраняется в сухом остатке после извлечения трех перечисленных фракций. Эта работа дает представление о простейших биохимических исследованиях, проводимых с использованием радиоактивного фосфора.

Материалы и оборудование: центрифуга, штатив для центрифужных пробирок, ножницы, пинцеты, корнцанги, кюветы с защитными экранами, подставки для кьельдалевских колб, асбестовые сетки, водяные бани, мишени из фольги, шприц на 1—2 мл, весы, пробирки конические центрифужные, пипетки на 1, 2 и 5 мл, пробирки с делениями, пастеровские пипетки, микропипетки, кьельдалевские колбы, колбы круглодонные, стаканы хими­ческие, мерные цилиндры на 1000 и 500 мл, чашки Петри, гомогенизатор, бачок для радиоактивных отходов, стеклянные палочки, предметные стекла, склянки для реактивов по 0,5 л, мерные колбы на 100 и 500 мл, реактивы на одно рабочее место — 0,6 н. хлорная или 5 % трихлоруксусная кислота (200—300 мл), этиловый спирт (200 мл), эфир, радиоактивный фосфор 32Р, дистиллированная вода, 0,2 М NaCl.

Крысам вводят препарат двузамещенного фосфата натрия, меченного радиоактивным фосфором 32Р, внутрибрюшинно в объеме 1 мл. Расчет количества изотопа, необходимого для введения животному, проводят тем же порядком, что и в упражнении 1. Время экспозиции после введения радиофосфора зависит от конкретной цели опыта, однако для изучения динамики включения 32Р необходимо выбрать несколько (по возможности больше) экспозиций, например 1, 2, 4, 6 ч и т. д.