Использование радионуклидов для изучения обмена веществ в организме животных (стр. 4 )

Окраска радиоавтографов. Проявленные влажные препараты окрашивают: мазки крови или костного мозга по Романовскому — Гимзе, срезы тканей — гематоксилин-эозином. Разведение краски по методу Романовского — Гимза подбирают опытным путем. В ряде случаев готовый фабричный краситель разводят в 2 раза, а время окраски составляет 5 мин. После окраски препараты промывают водой, проводят через 2 порции 96 % этилового, спирта и 2 порции ксилола (каждый по 5 мин), затем заливают канадским бальзамом и накрывают покровным стеклом. Мазки крови и костного мозга после окраски ополаскивают дистиллированной водой и сушат в вертикальном положении на подставке.

Изучение радиоавтографов. В зависимости от поставленной задачи радиоавтографы оценивают визуально или микроскопиче­ски (в том числе и под электронным микроскопом). Гистологиче­ские срезы для обычной микроскопии, а также мазки крови и костного мозга исследуют с помощью иммерсионного объектива. Вначале определяют фон путем подсчета фотоэмульсии на площади, равной площади клетки или ее ядра. Величина фона зависит от типа фотоэмульсии, режима проявления, условий экспозиции и т. д. В среднем для ядра клетки принято считать фон, равный 3—5 зернам. Методы оценки результатов зависят от цели работы, но они всегда должны быть совершенно одинаковыми для контрольной и опытной групп животных.

В большинстве экспериментов наиболее удобно оценивать плотность зерен проявленного серебра. Наиболее распространенным является визуальный подсчет зерен, но возможно и фотометрическим методом. Результаты авторадиографического эксперимента подлежат статистической обработке.

Условия правильного обращения с фотоэмульсией: 1) все операции с фотоэмульсией проводят только в темноте или при актиническом освещении (зеленый или желтый светофильтр); 2) фотоэмульсию, полученную от изготовителя, расплавляют при 40— 42 °С, остужают и хранят в холодильнике при 2—4 °С; 3) при хранении эмульсии соблюдают защиту от внешних источников облучения, светонепроницаемость, влагонепроницаемость, исключают колебания температуры, доступ паров кислот, перекиси водорода, аммиака и т. д.; 4) при соблюдении перечисленных условий эмульсия М сохраняет свои качества до 4 месяцев, эмульсия Р — до 2 месяцев.

Некоторые условия, обеспечивающие хорошее качество препаратов. В связи с тем, что фотоэмульсии (особенно Р) являются высокочувствительными, следует избегать всех возможных источни­ков возникновения фона (или так называемых зерен вуали) на приготавливаемых препаратах. Прежде чем использовать эмульсию, следует проверить ее годность, то есть наличие «фабричной вуали». Для этого несколько чистых стекол заливают эмульсией, проявляют через 12 ч и просматривают под микроскопом.

Вся посуда, связанная с фотообработкой, должна быть химически чистой (применение хромпика для ее мытья обязательно). Стекла для срезов и мазков, а также контрольные стекла должны быть тщательно обезжирены, поскольку на необезжиренные участки эмульсия не ложится. Неосторожное перемешивание и резкое погружение стекол могут быть источником сильного фона. Соприкосновение стекол или неосторожный захват стекла могут вызвать нарушение целостности всего слоя эмульсии или создать обширные участки почернения.

Чтобы избежать порчи препаратов во время экспонирования, следует соблюдать условия п. 3 (см. выше). Фотоэмульсия (особенно Р) обладает способностью набухать. Поэтому неосторожное покачивание стекол во время проявления и закрепления, а также сильная струя или повышенная температура проточной воды при промывании способны вызвать сползание всего слоя эмульсии.

Подсчет радиоавтографов удобнее проводить с помощью иммерсионных объективов.

В настоящей лабораторной работе предлагается выполнить два упражнения, которые позволяют освоить основные приемы работы при использовании радионуклидов для гистоавторадиографических исследований.

Упражнение 1. Исследование срезов тканей животных ги-стоавторадиографическим методом.

Животным вводят внутрибрюшинно 3Н-тимидин. Через час животных убивают декапитацией. Вырезают кусочки печени, селезенки и других органов размером 2х2х2 мм, быстро помещают их в фиксатор Карнуа, затем проводят гистологическую обработку, гистосрезы экспонируют с фотоэмульсией при 2—4°С в течение 14 суток, затем проводят фотообработку и подсчитывают радиоавтографы под микроскопом.

Материалы и оборудование: 3Н-тимидин, подопытные животные, ножницы, скальпели, пинцеты, шприц на 1 мл, вата, бумага фильтровальная, кювета, предметные стекла, химические стаканчики на 1000 мл, ультратермостат, холодильник, зеленый сфетофильтр, вертикальные штативы для предметных стекол, спирт 96 %, хлороформ, парафин, глицерин, ксилол, фотоэмульсии М и Р, проявитель для фотопластинок, фиксаж, краска Романовского—Гимза, дистиллированная вода, эфир, покровные стекла, канадский бальзам.

Выполнение работы.

Животному внутрибрюшинно ввести 3Н-тимидин из расчета 20 МБк/г массы и через час его убить декапитацией. Из печени и других исследуемых органов вырезать кусочки (максимальный размер 2х2х2 мм) и быстро поместить их в фиксатор Карнуа (6 частей спирта + 3 части хлороформа + 1 часть ледяной уксусной кислоты). Провести гистологическую обработку кусочков тканей по следующей батарее: фиксатор Карнуа — 40 мин, 1-й 96 % спирт—30 мин, 2-й 96 % спирт —30 мин, 1-й 100 % спирт — 15мин, 2-й 100 % спирт—15 мин, 1-й хлороформ — 5 мин, 2-й хлороформ— 5 мин, смесь состоящая из 1 части хлороформа и 1 части парафина — 20 мин, 1-й парафин — 60 мин, 2-й парафин — 60 мин (хлороформ можно заменить ксилолом). После этого залить кусочки в парафин, приготовить срезы толщиной 2—3 мкм и расположить их на предметном стекле, смазанном белком с глицерином, на расстоянии 1 см от каждого края.

Депарафинировать срезы в следующей батарее: 1-й ксилол — 3 мин, 2-й ксилол —3 мин, 3-й ксилол — 3 мин, 1-й 96 % спирт —3 мин, 2-й 96 % спирт — 3 мин, 70 %спирт — 3 мин, 1-я дистиллированная вода — 3 мин, 2-я дистиллированная вода — 3 мин.

Провести фотообработку срезов в следующем порядке. Достать эмульсию из холодильника, осторожно отложить нужное количество в химический стакан и расплавить в ультратермостате при 40—42 °С. Разбавить эмульсию смесью дистиллированная во­да (99 частей) + глицерин (1 часть) в соотношении 1:6. Разведенную эмульсию нагреть в течение часа при 40—42 °С, осторожно помешивая стеклянной палочкой. После этого в эмульсию погрузить предметное стекло, вынуть его, протереть марлей одну сторону, рассмотреть слой эмульсии при зеленом свете. Если на стекле не будет непрозрачных комочков и неравномерно распределенной эмульсии, то она готова к употреблению. В противном случае продолжить нагревание и помешивание до готовности. Приготовленные стекла залить готовой эмульсией, осторожно по­гружая каждое стекло в стаканчик, извлекая его и протирая об­ратную сторону марлей. Залитые стекла установить в вертикальные штативы и оставить на ночь для высушивания в защищенном от пыли месте. Избегая соприкосновений, сложить стекла в коробки, обеспечив при этом абсолютную свето - и влагонепроницаемость (можно использовать СаСl2). Коробки уложить на экспонирование в холодильник при 2—4°С на 14 сут для М и на 10 сут для Р.

После экспозиции проявить стекла в течение 3,5 мин при комнатной температуре в следующем проявителе: метол — 1 г, Na2SO4 — 75, гидрохинон — 4, Na2SОз — 55, КВг — 2,5 г, дистиллированная вода — 1л. Затем стекла осторожно ополоснуть дистиллированной водой и держать в течение 10 мин в закрепителе (гипосульфит — 250 г, дистиллированная вода — 1л). Стекла промыть в слабопроточной холодной воде от 30 мин до 12 ч. Промытые препараты окрасить гематоксилин-эозином, заключить в канадский бальзам и произвести подсчет радиоавтографов.

Упражнение 2. Исследование мазков крови и костного мозга гистоавторадиографическим методом.

Материалы и оборудование: те же, что и в упражнении 1.

Выполнение работы.

Животным вводят внутрибрюшинно 3Н-тимидин из расчета 20 МБк на 1 г массы. Через час берут пробы крови и костного мозга, делают мазки, высушивают их на воздухе и фиксируют в метаноле в течение 5 мин. Нанесение фотоэмульсий, экспозицию препаратов и их фотообработку делают так же, как и в упраж­нении 1. Для окраски мазков по Романовскому — Гимзе используют раствор стандартной краски из расчета 2—3 капли на 1 мл дистиллированной воды. Стекла с мазками помещают в чашки Петри на палочки (удобно использовать спички) мазками вниз. Затем в чашки наливают краску. Время окраски (20—40 мин) зависит от качества краски, окружающей температуры, рН воды. Окрашенные мазки обмывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и исследуют под микроскопом с иммерсионным маслом.

Контрольные вопросы.

1. Какие основные условия необходимо соблюдать при использовании радионуклидов в биологических исследованиях?

2. Порядок расчета активности, приготовление растворов радионуклидов для введения в организм подопытных животных.

3. В чем заключается подготовка рабочего места и проведение заключительных мероприятий при проведении экспериментов с радионуклидами?

4. Какие меченые соединения можно использовать для изучения белкового и нуклеинового обмена у животных?

5. Охарактеризуйте способы приготовления счетных образцов из биологических проб для радиометрии.

6. Какие основные преимущества радионуклидных методов исследования по сравнению с обычными.

7. На чем основан авторадиографический метод изучения обмена веществ?

7. ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1.

Значение поправочного коэффициента К = e0,693•t/T

на радиоактивный распад для различных значений времени t, выраженного в долях периода полураспада (по )

	K		К		K
0,00	1,00	0,60	1,52	3,00	8,00
0,02	1,02	0,70	1,62	3,50	11,36
0,04	1,03	0,80	1,73	4,00	16,00
0,06	1,04	0,90	1,86	4, 50	22,65
0,08	1,06	1,00	2,00	5,00	32,00
0,10	1,07	1,25	2,36	6,00	64,00
0,20	1,15	1,50	2,82	7,00	128,00
0,30	1,23	1,75	3,35	8,00	256,00
0,40	1,32	2,00	4,00	9,00	512,00
0,50	1,41	2,50	5,64	10,00	1024,00

Приложение 2

Таблица Белла

(по )

	∆= 1 %	∆= 2%	∆= 3 %	∆= 5 %	∆= 10 %
n ф	n	nф	n	nф	n	n ф	n	n Ф	n
1,3	240000	350000	60000	90000	27000	40000	9500	14000	2400	3500
1,5	89000	163500	22000	41000	10000	18000	3600	600	900	1600
1,7	47000	105000	12000	26000	5000	12000	2000	4000	470	1000
2,0	24000	68000	6000	17000	3700	7600	1000	2700	240	710
3,0	11500	46000	3000	11000	1300	5100	450	1800	115	450
5,0	2000	23000	500	5700	200	2600	80	900	20	230
10,0	500	16000	130	4000	60	1800	20	650	5	160
20,0	150	13000	40	3700	20	1500	6	540	(1,5)	130
50,0	34	11900	9	3000	4	1300	(1,3)	480	(0,34)	120
100,0	11	11200	3	2800		1200	(0,4)	450		112
		10000		2500		1100		400		100

Обозначения:

N пр + ф - количество импульсов фона и препарата в 1 минуту;

N ф количество импульсов фона в 1 минуту ;

n - число импульсов препарата и фона за t минут;

n ф - число импульсов фона а t минут.

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ч. Ванг, Д. Уиллис Радиоиндикаторный метод в биологии. – Атомиздат, 1969.

2. Дж. Дэвидсон Биохимия нуклеиновых кислот. М., «Мир», 1976.

3. Методы исследования нуклеиновых кислот. Под ред. . М., «Мир», 1970.

4. и др. Защита от ионизирующих излучений. М., «Энергоатомиздат», 1989, т.2

5. и др. Радиоавтография. М., Высшая школа, 1977.

6. Радиоактивные нуклиды в медико-биологических исследованиях. М.: Атомиздат, 1977.

7. . Радиоизотопные и радиоиммунологические исследования функции эндокринных желез. Киев, Здоровье, 1978.

СОДЕРЖАНИЕ

	Стр.
1. ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ РАБОТ С РАДИОАКТИВНЫМИ ИНДИКАТОРАМИ……………………………………………...	3
Лабораторная работа 1. Методы расчета активности и приготовление рабочих растворов радионуклидов………………………………	3
2. РАДИОНУКЛИДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МИНЕРАЛЬНОГО ОБМЕНА У ЖИВОТНЫХ……………………………………………….	10
Лабораторная работа 2. Исследование характера распределения, миграции, накопления и выведения фосфора в организме животных……..	11
3. РАДИОНУКЛИДЫ В ИЗУЧЕНИИ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА……	16
Лабораторная работа 3. Изучение белкового обмена у животных с помощью меченых аминокислот…………………………………………….	16
4. РАДИОНУКЛИДЫ В ИЗУЧЕНИИ ОБМЕНА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ………………………………………………………….	21
Лабораторная работа 4. Исследование биосинтеза (по скорости включения 32Р) высоко - и низкополимерных фракций РНК у животных в норме и при действии ионизирующей радиации………..	21
Лабораторная работа 5. Применение радионуклидов для изучения биосинтеза цитоплазматических и ядерных фракций РНК в организме облученных животных…………………………………………….	28
5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ	34
Лабораторная работа 6. Определение функционального состояния щитовидной железы IN VITRO по поглощению трийодтиронина, меченного 125j эритроцитами…………………………………………………………...	34
6. ПРИМЕНЕНИЕ РДИОНУКЛИДОВ В ГИСТОАВТОРАДИОГРАФИИ…………………………………………………………...........	35
Лабораторная работа 7. Изучение авторадиограмм мазков крови и срезов тканей животных и определение локализации радионуклида в клетках………………………………………………………………………	35
7. ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………………	41
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ	43