Изучение механизмов сочетанного влияния гестагенов и доксорубицина на клетки опухолевых линий HeLa и MCF-7 (стр. 2 )

Соединение	Концентрация соединений	Доксорубицин 10-5М
-	-	18,79+2,3*
АБМП	10-4М	52,48+4,0*
10-6М	40,72+4,3*
МПА	10-4М	52,35+6,9*
10-6М	35,78+2,5*
10-8М	30,26+1,7*
ЛГ	10-4М	39,86+5,7*
10-6М	34,66+1,7*
10-8М	27,68+3,0*

Примечание: *- достоверные отличия от контроля при р<0.05.

Показано, что сочетание АБМП с доксорубицином в значительно большей степени приводило к угнетению пролиферации клеток линии рака молочной железы линии MCF-7 по сравнению с доксорубицином, а также и при сочетании доксорубицина с другими гестагенами. Так, при сочетании АБМП в концентрации 10-6М и доксорубицина в концентрации 10-5М подавление жизнеспособности составляло более 40%, а при инкубации клеток только с цитостатиком в той же концентрации - не более 20 %.

Таким образом, сочетание АБМП с доксорубицином приводило к более эффективному угнетению пролиферации клеток этой линии.

При проведении аналогичных экспериментов с клетками HeLa в присутствии доксорубицина и гестагенов были получены данные, представленные в таблице 4.

Табл. 4. Подавление жизнеспособности клеток линии HeLa при инкубации с доксорубицином и гестагенами в течение 72 часов. Значения в клетках таблицы – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0%. Результаты представлены в виде М±SD, где M – среднее значение выборки, SD – стандартная ошибка среднего.

Соединение	Концентрация	Доксорубицин 10-5М
-	-	18,00±4,8
АБМП	10-6М	57,31±8,4*
10-8М	50,45±10,5*
МПА	10-6М	35,94±13,5
10-8М	27,78±3,1
ЛГ	10-6М	42,85±10,9*
10-8М	27,1±6,3

Примечание: *- достоверные отличия от контроля при р<0.05.

На основании полученных данных были построены следующие диаграммы (рис. 1,2):

Рис. 1. Подавление жизнеспособности клеток линии MCF-7 при инкубации с доксорубицином и гестагенами в течение 72 часов. Значения по оси ординат – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0%.

Примечание: *- достоверные отличия от контроля при р<0.05.

Рис. 2. Подавление жизнеспособности клеток линии HeLa при инкубации с доксорубицином и гестагенами в течение 72 часов. Значения по оси ординат – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0%.

Примечание: *- достоверные отличия от контроля, р<0.05. **- достоверные отличия от контроля, р<0.001. ♦ - достоверные отличия по отношению к веществам сравнения, р<0.05.

Подавление жизнеспособности в целом было более выражено в случае клеток линии HeLa, по сравнению с клетками линии MCF-7. Приведенные данные показывают, что сочетание АБМП и доксорубицина, даже при концентрации гестагена 10-8М приводило к угнетению жизнеспособности клеток линии HeLa более чем на 50%. Cочетание того же цитостатика с другими прогестинами обладало меньшим антипролиферативным эффектом и приводило к подавлению жизнеспособности на 27,7% и 27,1% при инкубации с ЛГ и МПА в концентрации 10-6М соответственно.

Таким образом, АБМП, в сравнении с другими гестагенами (МПА, левоноргестрел) продемонстрировал выраженную антипролиферативную активность в отношении клеток рака шейки матки линии HeLa. Также сочетание АБМП с доксорубицином приводило к более эффективному угнетению пролиферации клеток этой линии. На основании полученных данных были сформированы ряды эффективности исследуемых соединений. Ряд эффективности исследуемых гестагенов в комбинации с доксорубицином в отношении подавления жизнеспособности опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 можно представить следующим образом (построен в порядке убывания цитостатической активности соединений, на основе тенденции подавления жизнеспособности клеток. Отличия от контроля являются статистически достоверными для всех веществ (при концентрации 10-6 М, р<0.05). «Докс.» - доксорубицин:

Ряд эффективности исследуемых соединений в комбинации с доксорубицином в отношении подавления жизнеспособности опухолевых клеток аденокарциномы шейки матки человека линии HeLa может быть представлен следующим образом (построен в порядке убывания цитостатической активности соединений). Отличия между веществами достоверны для комбинации «АБМП+доксорубицин» по отношению к другим комбинациям (р<0,05). Отличия от контроля являются статистически достоверными для всех веществ (при концентрации 10-6 М, р<0.05). «Докс.» - доксорубицин:

Докс. + АБМП

Для изучения возможного механизма антипролиферативного действия гестагенов мы оценили их влияние на апоптоз культивируемых опухолевых клеток MCF-7 с помощью флуориметрического анализа электрофореграмм экстракта геномной ДНК исследуемых клеток.

В опыте клетки аденокарциномы молочной железы линии MCF-7 инкубировали с гестагенами в течение 72 часов. Контролем служили клетки, инкубируемые в тех же условиях, но в отсутствии соединений. Данные исследования приведены в таблице 5.

Табл. 5. Деградация ДНК в клетках культуры MCF-7 при инкубации с АБМП и прогестероном в течение 72 часов.

Соединение	Концентрация соединений, моль/л	Коэффициент отношения фрагментированной ДНК к высокомолекулярной, %
АБМП	10-6	20±2
10-8	24±3
Прогестерон	10-6	20±2
10-8	22±2
Контроль	-	22±3

Таким бразом, не было показано статичтичеки значимых различий в изменении фрагментации ДНК при действии различных гестагенов.

С целью выявления концентрационной зависимости индукции апоптоза при воздействии доксорубицина на исследуемые клетки (положительный контроль) было проведено исследование дозовой и временной зависимости действия доксорубицина на фрагментацию ДНК клеток культуры MCF-7.

Для проведения исследования были установленные следующие контрольные точки: время инкубации составило 24, 48 или 72 часа, концентрации доксорубицина составили 5*10-5, 5*10-6, 5*10-7М. Контрольную группу образцов инкубировали в тех же условиях в отсутствие доксорубицина. Данные исследования представлены в таблице 6.

Табл. 6. Фрагментация ДНК в клетках культуры MCF-7 при инкубации с доксорубицином.

Соединение	Время инкубации 24 ч	Время инкубации 48 ч	Время инкубации 72 ч	Контроль
Доксорубицин 5*10-5 М	41±4*	51±8*, L	64±8*	24±3
Доксорубицин 5*10-6 М	25±5	38±4*	52±7*, L
Доксорубицин 5*10-7 М	18±6	28±4	31±7

Примечание: * - достоверные отличия от контроля при р<0.05. L – присутствовала визуализация специфической фрагментации ДНК («лестница ДНК») на электрофореграммах образцов.

Для оценки индукции апоптоза при совместном действии гестагенов и доксорубицина инкубацию клеток с исследуемыми веществами проводили в течение 72 часов, контрольную группу образцов инкубировали в тех же условиях в отсутствие веществ. В последние 24 часа инкубации в культуру клеток вносили доксорубицин в концентрации 5*10-6 М. Одну из контрольных групп также инкубировали с доксорубицином в течение 24 часов. Данные исследования представлены в таблице 7.

Табл. 7. Фрагментация ДНК в клетках культуры MCF-7 при инкубации с АБМП и прогестероном в течение 3 суток с добавлением доксорубицина в концентрации 5*10-6 М в последние 24 часа инкубации.

Соединение	Концентрация веществ, моль/л	Отношение фрагментированной ДНК к высокомолекулярной, %
АБМП + Доксорубицин	10 -6	17±2
10 -7	20±3
10 -8	21±3
Прогестерон + Доксорубицин	10 -6	21±2
10 -7	18±3
10 -8	17±2
Доксорубицин	5·10-6	21±2
Контроль		17±3

На основании приведенных данных можно заключить, что при сроке инкубации 72 часа с гестагенами и 24 часа с доксорубицином в концентрации 5*10-6М выраженность апоптоза при воздействии гестагенов в комбинации с доксорубицином на культуру клеток не имеет достоверных отличий от контроля при уровне значимости p<0,05. Изменения эффекта при совместной инкубации с доксорубицином не наблюдается, не отмечено также и проявления цитостатического эффекта непосредственно доксорубицина при данных условиях инкубации. Отсутствие корреляции эффекта снижения жизнеспособности по данным МТТ-теста и эффекта индукции апоптоза при совместном действии гестагенов и доксорубицина можно объяснить следующим образом: можно предположить, что ингибирование роста клеток в присутствии гестагенов обусловлено замедлением репликативных процессов. Возможно, клетки переходят в секреторную фазу или фазу дифференцировки, запускается каскад ферментативных реакций, приводящий с течением времени к гибели клеток. На это указывает и тот факт, что цитостатическое действие гестагенов развивается при длительной инкубации (более 3 суток). Так, время удвоения ДНК для клеток MCF-7 = 22 часа, для клеток HeLa = 18 часов. Доксорубицин в концентрации 5*10-6М вызывает торможение роста клеток более чем на 50% уже при инкубации в течение 48 ч, как это было показано на клетках линии MCF-7.