Изучение механизмов сочетанного влияния гестагенов и доксорубицина на клетки опухолевых линий HeLa и MCF-7 (стр. 3 )

Следовательно, для осуществления цитостатического эффекта доксорубицина должно пройти около 2-х клеточных циклов. Такой быстрый эффект доксорубицина связан с прямым воздействием на ДНК делящейся опухолевой клетки (ДНК-алкилирующее действие). В частности, по данным литературы (Thuneke и соавт., 2000), МПА оказывает на клетки линии рака молочной железы человека T-47D двухфазное действие: при инкубации в течение 24 и 48 часов – стимулирует пролиферацию, а при времени инкубации 72 ч – ингибирует.

Продолжая изучение роли апоптоза в механизме действия гестагенов, мы исследовали экспрессию антиапоптотического белка bcl-2, методом иммуногистохимического окрашивания. Клетки культуры MCF-7 и HeLa инкубировали в течение 72 часов в присутствии исследуемых веществ. Контролем служили клетки, инкубируемые в тех же условиях, но в отсутствие исследуемых соединений. С помощью флуоресцентного микроскопа “Axiostar” были получены изображения клеток в спектре видимого света, а также комбинированные изображения при возбуждении флюоресценции маркера вторичных антител УФ-излучением.

Как в опыте, так и в контроле оценивали соотношение количества флуоресцирующих клеток к общему количеству клеток в поле зрения, а также интегральную площадь, соответствующую значениям флуоресценции выше фоновых (программа Image Pro Plus 5.0). Результаты, полученные в результате проведения обработки первичных данных, представлены в таблице 8.

Табл. 8. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к Bcl-2 в культуре клеток MCF-7.

Соединение	Концентрация, моль/л	Соотношение*	S окрашивания
АБМП	10-4	0,234±0,09	15,9
10-6	0,211±0,18	31,1
Контроль 1	0,294±0,07	30,5
ЛНГ	10-4	0,301±0,12	17,1
10-6	0,272±0,16	26,8
Контроль 2	0,213±0,08	42,1
Доксорубицин	10-5	0,182±0,10	3,9
10-6	0,231±0,08	10,2
Контроль 3	0,215±0,22	29,0

Примечание: Соотношение* - отношение количества флуоресцирующих клеток к общему количеству клеток в поле зрения; S окрашивания – интегральная площадь, соответствующая значениям флуоресценции выше фоновых, вычисленная в процентах по отношению к фону, отражает плотность монослоя клеток.

Полученные данные показывают, что отношение флуоресцирующих клеток к общему количеству клеток в поле зрения при уровне значимости p<0,05 достоверно не отличается от контроля ни в одном из образцов.

Таким образом, при анализе экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 в культуре клеток MCF-7 при инкубации с гестагенами и доксорубицином с помощью иммуноокрашивания не было выявлено достоверных отличий от контроля при времени инкубации 72 часа. Это позволяет говорить об отсутствии значимого влияния исследуемых веществ на экспрессию фактора Bcl-2 в данных условиях. .

Для оценки активности каспазы-3 как ключевого компонента каскада апоптотических реакций использовали культуру клеток HeLa. Клетки культуры MCF-7 не использовали, так как данная линия клеток несет мутацию в гене каспазы-3, инактивирующую фермент. Для изучения активности каспазы-3 под действием гестагенов клетки инкубировали с исследуемыми соединениями в течение 72 часов. Клетки контрольной группы инкубировали в тех же условиях в отсутствие соединений. В качестве первичного оценочного параметра использовали величину оптической плотности образцов при длине волны поглощения субстрата λ=405нм, измеренную в условных единицах Полученные данные представлены в таблице 9.

Табл. 9. Активность каспазы-3 в культуре клеток HeLa при инкубации с гестагенами.

Соединение	Концентрация вещества, моль/л	Активность каспазы-3, усл. ед.
МПА	10-6	0,16±0,03
ЛНГ	10-6	0,24±0,07
АБМП	10-6	0,3±0,04
Контроль	-	0,25±0,07

Показано, что при сроке инкубации 72 часа активность каспазы-3 при инкубации с АБМП превышает таковую при инкубации с другими гестагенами и в контрольной группе, однако на уровне значимости p<0,05 данные отличия не являются достоверными. Аналогичный опыт был проведен с использованием сочетания гестагенов с доксорубицином. Клетки инкубировали с исследуемыми соединениями и их комбинациями в течение 72 часов, время инкубации с доксорубицином составляло 24 часа, концентрация доксорубицина, которую использовали в исследовании – 5*10-6М. Контрольную группу клеток инкубировали в тех же условиях в отсутствие соединений. Полученные результаты представлены в таблице 10.

Табл. 10. Активность каспазы-3 в культуре клеток HeLa при инкубации с гестагенами и доксорубицином.

Соединения	Концентрация веществ, моль/л	Активность каспазы-3, усл. ед.
МПА+ Dox	10-6	0,22±0,04
ЛНГ+ Dox	10-6	0,24±0,08
АБМП + Dox	10-6	0,41±0,09*
Доксорубицин	5·10-6	0,27±0,06
Контроль	-	0,23±0,06

Примечание: *- достоверные отличия от контроля при р<0.05.

Показано, что наибольшей величины уровень активности каспазы-3 достигает при инкубации клеток с АБМП в комбинации с доксорубицином. Так же необходимо отметить, что активность каспаз при инкубации с МПА (0,16 ед.) и ЛГ (0,21 ед.) была значительно ниже, чем при инкубации с АБМП (0,3 ед.), и при этом отличалась от контрольной группы незначительно (0,25 ед.), данные отличия не были достоверными. Значение активности каспазы-3 при воздействии на клетки доксорубицина совместно с АБМП превышало активность фермента в группе контроля, данное отличие было статистически значимо (р<0.05).

На основании полученных результатов можно сделать следующий вывод: при совместном действии доксорубицина и АБМП наблюдается повышение активности каспазы-3, достоверно превышающее таковую в контроле. Это позволяет предположить, что при данной дозе и времени действия наблюдается активация системы апоптоза с участием каспаз, и данный эффект превышает таковой при воздействии цитостатического препарата доксорубицина и гестагена АБМП отдельно друг от друга.

Согласно поставленной цели – поиску эффективных комбинаций для использования в химиотерапии опухолей с использованием новых синтетических гестагенов как потенциальных противоопухолевых средств и веществ, повышающих эффективность цитостатиков, проведение данной экспериментальной работы позволило детально исследовать влияние гестагенов на жизнеспособность опухолевых клеток гормончувствительных клеточных культур MCF-7 и HeLa, в том числе АБМП как самостоятельного вещества и в комбинации с доксорубицином, в сравнении с используемыми в клинической практике гестагенами.

АБМП как самостоятельное вещество обладает выраженной цитостатической активностью в отношении клеточных культур MCF-7 и HeLa.

Показано, что АБМП дозозависимо тормозит рост опухолевых клеток при использовании в комбинации с доксорубицином, причем этот эффект реализуется в условиях краткосрочного воздействия гормонального вещества (72 часа) и цитостатика (24 часа на фоне воздействия гормона). Максимально действующая концентрация – 10-6М.

Таким образом, комбинация АБМП и доксорубицина обладает выраженной цитостатической активностью в отношении клеточных культур MCF-7 и HeLa при инкубации в течение 72 часов.

Возможные механизмы, обусловливающие синергизм в цитостатическом действии гестагенов и доксорубицина, по-видимому, связаны с изменением метаболизма опухолевых клеток, 1) не затрагивающими при коротких сроках инкубации экспрессию фактора bcl-2; 2) не приводящими к индукции апоптоза при условии применения гестагена как самостоятельного средства; и 3) приводящими к активации внутриклеточных систем, участвующих в реализации клеточной гибели посредством апоптоза. В случае применения комбинации синтетический гестаген (АБМП) + антрациклиновый антибиотик (доксорубицин) этот эффект активации апоптоза достигал максимума. В то же время, эффект активации сигнальных систем (каспазы-3) не является определяющим в апоптозе клеток некоторых клеточных популяций (в частности, линии клеток MCF-7), что позволяет предполагать реализацию цитостатического действия гестагенов в комбинации с цитостатиками через изменения на уровне различных внутриклеточных путей метаболизма.

Этот эффект может быть реализован, со стороны гестагенов – через быстрые эффекты, опосредуемые мембранными рецепторами, влияющими на градиенты биологически активных веществ в клетке, и, со стороны цитостатика – его перераспределением (усилением аккумуляции вследствие ингибирования системы транспорта ксенобиотиков из клетки) под влиянием гестагенов.

Полученные данные свидетельствуют о цитостатической активности нового оригинального отечественного гестагена. В работе обоснована целесообразность комбинированного применения гестагена АБМП с цитостатиками. Новый гестаген, АБМП, обладает химиосенсибилизирующей активностью и может быть рекомендован для последующего изучения с перспективой использования в клинической практике в качестве универсального модулятора эффекта химиотерапевтических средств.

Таким образом, действие гестагенов на клетки-мишени можно представить в виде следующей схемы, построенной на основании данных литературы, а также данных, полученных в проведенном исследовании (рис. 3.)

Рис. 3. Механизмы регуляции пролиферативной активности клеток-мишеней гестагенами.

1 – Антиапоптотические факторы

В проведенном исследовании показано отсутствие влияния гестагенов на экспрессию фактора bcl-2.

2 – Факторы роста (EGF – эпидермальный фактор роста, IGF – инсулиноподобный фактор роста)

По данным литературы, гестагены могут усиливать пролиферативный эффект факторов роста, влияя на внутриклеточные пути проведения сигнала [Carvajal et al., 2005; Wang et al., 2006]

3 – Подавление факторов мультилекарственной резистентности

По данным литературы, наблюдается более выраженное накопление цитостатических веществ в клетках-мишенях в присутствии гестагенов, а также усиление эффекта цитостатических средств в отношении резистентных к ним клеток [Т. Федотчева и соавт., 2003 г.]

4 – Проапоптотические факторы (bax, bcl-XS)

Активность проапоптотических факторов возрастает при действии гестагенов [Liszewska et al., 2005; Choksuchat et al., 2009]

5 – Медиаторы биологического сигнала

В проведенном исследовании было показано, что активность каспазы-3 возрастает при действии гестагенов на клетки-мишени линий HeLa и MCF-7.

ВЫВОДЫ.

1. АБМП и вещества сравнения: ЛНГ, МПА, прогестерон обладают цитостатической активностью в отношении опухолевых клеток рака молочной железы человека MCF-7 и рака шейки матки человека HeLa.

2. Снижение жизнеспособности клеток опухолевых линий HeLa и MCF-7 возрастает с увеличением дозы и времени действия исследуемых веществ.

3. В цитостатическом действии сочетания гестагенов и доксорубицина выявлен синергизм, наиболее выраженный в случае АБМП в клетках MCF-7 и в клетках HeLa. Комбинация АБМП и доксорубицина обладает выраженной цитостатической активностью в отношении клеточных культур MCF-7 и HeLa при инкубации в течение 72 часов с добавлением доксорубицина в последние 24 часа инкубации.

4. АБМП и другие гестагены не оказывают статистически значимого влияния на экспрессию антиапоптотического фактора bcl-2 в клетках-мишенях при инкубации в течение 72 часов. Это позволяет сделать вывод о том, что реализация цитостатического действия гестагенов при коротких сроках инкубации осуществляется без влияния на экспрессию фактора bcl-2.

5. Сочетанное использование АБМП (в отличие от препаратов сравнения ЛНГ и МПА) и доксорубицина приводит к достоверной активации каспазы-3. Таким образом, при совместном действии АБМП и доксорубицина происходит активация систем, участвующих в реализации апоптоза клеток. В данном случае показано превосходство АБМП по отношению к препаратам сравнения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Прогестагены могут быть рекомендованы для применения в клинической практике в комбинированной терапии в сочетании с доксорубицином при лечении гормонозависимых опухолей женской репродуктивной системы.

2. Рекомендовано дальнейшее исследование свойств АБМП как нового прогестагена с противоопухолевой активностью для внедрения в клиническую практику.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. , , «Влияние гестагенов на апоптоз клеток культуры HeLa и MCF-7». Тезисы. Материалы XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», c. 246

2. , , "Влияние гестагенов на жизнеспособность клеток культуры HeLa и экспрессию фактора Bcl-2 при изолированном применении и в сочетании с цитостатическими средствами». Тезисы. Российский терапевтический журнал, №1/2008? c. 22-28

3. , , «Новый отечественный гестаген с противоопухолевой активностью». Вестник РАМН, №5/2007:27-32.

4. , , . «Регуляция гестагенами пролиферативной активности клеток-мишеней». Вестник РОНЦ им. РАМН, т. 19, №1/2008, с. 22-28

5. , , . Влияние нового отечественного гестагена с противоопухолевой активностью на апоптоз опухолевых клеток культуры HELA и MCF-7. III съезд фармакологов России, С.-П. сентябрь, 2007. Ж. «Психофармакология и биологическая наркология» т.7, спец. Выпуск, ч.1, с. .

6. , , . Сочетанное действие гестагенов и доксорубицина на клетки культур опухолевых линий HeLa и MCF-7. Вестник РГМУ, 2009, №1, с. 20-24