Изучение механизмов сочетанного влияния гестагенов и доксорубицина на клетки опухолевых линий HeLa и MCF-7 (стр. 1 )

На правах рукописи

АТРОШКИН Кирилл Андреевич

Изучение механизмов сочетанного влияния гестагенов и доксорубицина на клетки опухолевых линий HeLa и MCF-7

14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2009 г.
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Д. м.н., профессор ,

Д. м.н., профессор

Ведущая организация:

Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Защита состоится «12» мая 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при Российском государственном медицинском университете

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «27» марта 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

В настоящее время химиотерапия становится важнейшим, а в некоторых случаях основным методом лечения при злокачественных новообразованиях. В лечении злокачественных новообразований используют как цитостатические средства, так и гормонотерапию, и выбор между ними не всегда очевиден. Применение химиотерапевтических средств сопряжено с развитием побочных эффектов, в некоторых случаях требующих снижения дозы или полной отмены препарата. Побочные эффекты системной химиотерапии существенно снижают качество жизни пациентов, зачастую становясь причиной прекращения курса терапии. Токсическое действие цитостатических агентов на организм проявляется в первую очередь воздействиями на костномозговое кроветворение, клетки иммунной системы и функции желудочно-кишечного тракта, а также, в некоторых случаях, вторичной канцерогенностью. Снижение дозы препарата, в свою очередь, может приводить к неэффективности лечения. Однако, несмотря на то, что раковые клетки отличает менее дифференцированная морфология, известно, что большая часть новообразований, проистекающих из гормонозависимых тканей, сохраняет рецепторный аппарат, а в некоторых случаях количество рецепторов в опухолевой ткани даже увеличивается. Этот факт может быть использован для разработки новых схем лечения пациентов с гормонзависимыми опухолями с использованием гормонов [Hassett et al., 2005].

Важность исследования новых синтетических гестагенов как потенциальных химиосенсибилизаторов связана с тем, что гестагенные препараты могут применяться и как самостоятельные препараты в лечении гормонзависимых опухолей. В научной литературе представлены данные, отражающие потенциальную способность гестагенов к сенсибилизации опухолевых клеток в отношении некоторых химиотерапевтических средств. Тем не менее, механизмы этого процесса в настоящее время изучены недостаточно. Предполагается, что сенсибилизирующий эффект может достигаться за счет действия гестагенов на экспрессию факторов, регулирующих пролиферацию, апоптоз и дифференцировку клеток [Briton-Jones et al., 2006; Li X, 2003].

В современной клинической практике для лечения рака матки, рака молочной железы и яичников в качестве дополнительной или паллиативной терапии используются 17-оксипрогестерона капронат, медроксипрогестерона ацетат (МПА) и другие, по химической структуре являющиеся производным прогестерона. В настоящее время в России активно ведется поиск новых эффективных гестагенов, в частности, с сотр., ФГУ Эндокринологический научный центр РАМН синтезирован новый оригинальный отечественный гестаген АБМП (17-альфа-ацетокси-3-бета-бутаноилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он) [ и соавт., 2007].

В проведенных ранее исследованиях обнаружена высокая специфическая гестагенная активность, химическая стабильность, отсутствие значимой андрогенной и эстрогенной активности АБМП. АБМП не вызывает гибели животных даже при использовании в дозах, превышающих эффективные в сотни раз. Низкая токсичность препарата в высоких дозах служит основанием для их клинического изучения как противоопухолевых и химиосенсибилизирующих средств.

Настоящая работа посвящена исследованию АБМП в сравнении с прогестероном, МПА и левоноргестрелом (ЛНГ), как потенциальных противоопухолевых и химиосенсибилизирующих веществ, а также изучению молекулярных механизмов действия перечисленных гестагенов на клетки-мишени.

Цель исследования: исследование свойств гестагенов как цитостатических средств и модуляторов сенсибилизации опухолевых клеток к химиотерапии, а также выявление молекулярных механизмов действия гестагенов на пролиферацию клеток-мишеней.

Задачи исследования:

1). Исследовать дозовую и временную зависимость действия гестагенов на апоптоз клеток-мишеней в клеточной культуре непосредственно и в сочетании с доксорубицином.

2). Оценить влияние гестагенов на уровень экспрессии фактора bcl-2 как ключевого фактора, участвующего в регуляции роста и апоптоза.

3). Отобрать наиболее эффективные соединения и сочетания соединений на основании полученных данных.

Научная новизна работы. Впервые с помощью современных молекулярно-биологических методов изучены молекулярные механизмы синергизма в цитостатическом действии новых гестагенов и доксорубицина (химиосенсибилизации) на модели клеточной культуры рака молочной железы человека MCF-7 и аденокарциномы шейки матки HeLa.

Показано, что возможные механизмы, обусловливающие синергизм в цитостатическом действии новых гестагенов и доксорубицина в клетках MCF-7 и HeLa связаны с изменением активности каспазы 3 при отсутсвии значимого влияния на уровень фактора bcl-2.

Практическая значимость работы. Полученные в работе результаты обосновывают целесообразность клинического изучения новых отечественных гестагенов в качестве противоопухолевых средств и химиосенсибилизаторов для использования в комбинации с химиотерапевтическими средствами.

Внедрение в практику. Результаты исследования и ряд примененных в работе методов внедрены в процесс обучения студентов на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии МБФ РГМУ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Прогестагены являются модуляторами цитостатического эффекта химиотерапевтических средств, способствуя значительному усилению эффекта последних при применении in vitro.

2. Комбинация прогестагенов и широко используемых химиотерапевтических средств (таких, как антрациклиновые антибиотики), с более высокой результативностью обеспечивает подавление роста опухолевых клеток культур гормонозависимых опухолей (рака молочной железы и рака шейки матки), чем применение каждого из этих веществ в отдельности.

3. При использовании комбинации гестагенов и химиотерапевтических средств наблюдается активация системы каспаз, ответственных за реализацию клеточного апоптоза.

Апробация работы. Официальная апробация работы состоялась на совместной конференции сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и кафедры экспериментальной и теоретической физики медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Материалы диссертации представлены на IX Пироговской студенческой научной конференции молодых ученых (2005), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав, посвященных обзору литературы, описанию методов исследования, изложению результатов работы и их обсуждению, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 124 источника. Работа изложена на 126 страницах, иллюстрирована 20 рисунками, 10 таблицами и 3 схемами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

В исследованиях использовали клеточные культуры HеLа (эпителиоидный рак шейки матки человека), MCF-7 (рак молочной железы человека). Культивирование клеток осуществлялось в стерильных условиях с использованием ламинарбокса ЛБ-В (Россия). Клетки инкубировали при 37º С в условиях 5% СО2 при относительной влажности воздуха 95%. При культивировании клеток использовали стандартную среду DMEM с добавлением 20 % термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотика гентамицина сульфата концентрации 40 мкг/мл.

Влияние гестагенов: прогестерона ("Sigma", США), левоноргестрела ("Sigma", США), медроксипрогестерона ацетата ("Sigma", США), а также нового прогестагена 17-α-ацетокси-3-β-бутаноилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-она (АБМП, синтезирован в ЭНЦ и ОНЦ РАМН с сотр. [ В, и соавт, 2005])и доксорубицина (Верофарм, Россия) на жизнеспособность чувствительных и резистентных опухолевых клеток оценивалось методом МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый) – теста. Метод МТТ позволяет оценить жизнеспособность клеток по их метаболической активности, так как только дегидрогеназы живых и метаболически активных клеток способны превращать бледно-желтый водорастворимый МТТ в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде [Mealey et al., 2002].

Оценку экспрессии онкобелка bcl-2 в клетках осуществляли методом иммуногистохимического окрашивания. Метод иммуногистохимического окрашивания образцов основан на связывании первичных моноклональных антител с онкобелком bcl-2 и последующим присоединением вторичных антител, меченых флуоресцеином. Количество онкопротеина в образце оценивали на флуоресцентном микроскопе методом флуориметрии с использованием программного обеспечения ImageProPlus 5.0 (MediaCybernetics, США).

Оценку апоптоза на основании активности специфических ферментов проводили методом колориметрического измерения активности каспазы-3 при помощи набора реагентов (Promega, США), по методике изготовителя. Измерение активности каспазы-3 основано на расщеплении субстрата, меченого хромофором, под действием активной каспазы-3 и высвобождении хромофора, который окрашивает среду в желтый цвет. Окрашивание регистрировали с помощью спектрофотометра (Shimadsu, Япония) при длине волны λ=405 нм. Количество свободного красителя, и, соответственно, интенсивность окрашивания пропорциональны активности каспазы в исследуемом образце. Повышение активности каспазы свидетельствует об индукции процесса апоптоза в исследуемых клетках.

Выделение ДНК из образца проводили по методике экстракции смесью фенол-хлороформ [Maniatis T, 1989], для получения экстракта ДНК, пригодного для электрофоретического исследования.

Для оценки апоптоза в культуре клеток использовали электрофорез экстракта геномной ДНК культуры клеток в агарозном геле и флуориметрическую оценку соотношения фрагментированной/ высокомолекулярной ДНК [Daniel et al, 1999].

Электрофорез ДНК в агарозном геле проводили по стандартной методике (Maniatis T, 1989). Регистрацию флуоресценции проводили на установке “Vilber Lourmat”, США с использованием оптической системы производства “Nikon”, Германия. Последующую оценку электрофореграммы проводили с использованием программного обеспечения Image Pro Plus, (“Media Cybernetics”, США). В качестве первично измеряемого параметра в работе использовали интенсивность флуоресценции бромистого этидия при возбуждении УФ-излучением с λmax=254нм. В качестве оценочного параметра для определения степени апоптоза в культуре использовали коэффициент, отображающий соотношение областей нормализованной по площади и по средней величине интенсивности флуоресценции сильно и слабо фрагментированной ДНК. Статистическую достоверность результатов оценивали с помощью непараметрического рангового критерия Т – критерия Уилкоксона (Манна-Уитни) для уровня значимости a = 5% и Т – критерия Стьюдента для уровня значимости a = 0,1 -5%. Различия считались достоверными при уровне статистической значимости p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

При исследовании влияния АБМП и веществ сравнения (левоноргестрел, МПА, прогестерон) на жизнеспособность опухолевых клеток гормончувствительных клеточных культур MCF-7 и HeLa был выявлен их цитостатический эффект - подавление жизнеспособности клеток. При инкубации в течение 7 суток для всех изучаемых гестагенов наблюдали выраженную концентрационную зависимость цитостатического действия на опухолевые клетки. АБМП в концентрации 10-6М демонстрировал более выраженное подавление жизнеспособности клеток по сравнению с прогестероном (р<0.05).

Полученные результаты согласуются и дополняют результаты, полученные ранее на нашей кафедре [Т. Федотчева и соавт., 2003 г.].

Для изучения механизмов цитостатической активности было исследовано влияние АБМП и веществ сравнения на жизнеспособность клеток, оцененную по методике МТТ-теста. Кроме того, было исследовано действие гестагенов на жизнеспособность клеток в комбинации с антрациклиновым антибиотиком (доксорубицин).

Жизнеспособность клеток рака молочной железы линии MCF-7 при инкубации с гестагенами оценивали с помощью МТТ теста. Для проведения опыта клетки аденокарциномы шейки матки линии MCF-7 инкубировали с гестагенами в течение 72 часов. В качестве контроля использовали клетки той же линии, инкубируемые в тех же условиях, но в отсутствие исследуемых соединений.

Табл. 1. Подавление жизнеспособности клеток культуры MCF-7 при инкубации с гестагенами в течение 72 часов. Значения в клетках таблицы – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0. Результаты представлены в виде М±SD, где M – среднее значение, SD – стандартная ошибка среднего.

Соединение	Концентрация
10-4М	10-5М	10-6М	10-8М
АБМП	49,67±17,7*	25,1±7,2	24,30±5,3*	10,33±4,1
МПА	33,09±3,8*	10,45±4,1	10,1±0,8	10,05±1,0
ЛГ	28,85±3,1*	11,1±3,8	12,09±0,4	8,85±0,8
ПГ	45,77±10,7*	42,32±5,5*	21,82±1,9*	9,41±5,7

Примечание: *- достоверные отличия от контроля, р<0.05.

Согласно полученным данным, АБМП подавлял рост клеток в культуре MCF-7, причем для концентрации 10-4 М этот эффект был более выражен для АБМП, нежели для веществ сравнения. В концентрации 10-4 моль/л подавление жизнеспособности при инкубации с АБМП в течение 72 часов составило около 50%, 45% для прогестерона, 33% для МПА и менее 30% для левоноргестрела.

Подавление жизнеспособности клеток линии аденокарциномы шейки матки HeLa при инкубации с гестагенами оценивали с помощью МТТ теста. Для проведения опыта клетки линии аденокарциномы шейки матки HeLa инкубировали с гестагенами в течение 72 часов. В качестве контроля использовали клетки той же линии, инкубируемые в тех же условиях, но в отсутствие исследуемых соединений (табл.2).

Табл. 2. Подавление жизнеспособности клеток линии HeLa при инкубации с гестагенами в течение 72 часов. Значения в клетках таблицы – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0%. Результаты представлены в виде М± SD, где M – среднее значение выборки, SD – стандартная ошибка среднего.

Соединение	Концентрация
10-6М	10-8М
АБМП	35,58±1,8**	27,1±4,3*
МПА	31,18±1,02*	18,8±0,8
ЛГ	50,18±5,5*	18,4±2,3

Примечание: *- достоверные отличия от контроля, р<0.05. **- достоверные отличия от контроля, р<0.001.

Было показано, что АБМП не уступает по цитотоксической активности МПА

Подавление жизнеспособности клеток рака молочной железы линии MCF-7 при инкубации с доксорубицином и гестагенами также оценивали с помощью МТТ теста. Концентрация доксорубицина была одинаковой и составляла 10-5М, время инкубации с цитостатиком составляло 24 часа, поскольку при данной дозе и времени действия доксорубицин в отдельности достоверно не подавляет жизнеспособность клеток исследованных опухолевых линий. Контролем служили клетки, инкубируемые в тех же условиях, но в отсутствии как цитостатика, так и гестагенов. Полученные данные представлены в таблице 3.

Табл. 3. Подавление жизнеспособности клеток линии MCF-7 при инкубации с доксорубицином и гестагенами в течение 72 часов при добавлении доксорубицина в последние 24 часа инкубации. Значения в клетках таблицы – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0%. Результаты представлены в виде М±SD, где M – среднее значение выборки, SD – стандартная ошибка среднего.