Был сделан обзор (Goncharenko et al., 1998) результатов многолетних исследований белорусской школы лесных генетиков. У сосен (изучены 11 видов и подвидов) выявлено до 4.5 аллелей на локус, немного уступают им ели (среди 7 таксонов число аллелей достигает 3.7). Пихты проявляют уровень аллельного разнообразия (максимальная величина показателя не превышала 2.5 среди 6 видов), который кажется низким лишь на фоне огромного генетического разнообразия сосен и елей. Ряд покрытосеменных видов также обладают большим запасом генетической изменчивости. У дубов, например, выявляется аллеля на локус (Muller-Starck, Ziehe, 1991; Kremer, Petit, 1993; Mattila et al., 1994; Kleinschmit et al., 1995; Samuel et al., 1995; Hertel, Zaspel, 1996). Информация об уровне изменчивости нужна в качестве критерия для исключения случаев, когда внутрипопуляционное разнообразие сохраняемого объекта будет меньше уровня, сформированного в течение длительного времени в популяциях. Как уже отмечалось, важно сохранить вид не просто как таксон, а как совокупность популяций (Мамаев и др., 1988) со всем их генетическим разнообразием.
Очень эффективно изоферментные маркеры применяются для идентификации клонов и другого вегетативного материала, требующих сохранения. В качестве примера можно привести следующие две работы (Reiseberg, 1988; Millar, Westfall, 1992). В результате нарушения среды обитания Cercocarpus traskiae из Калифорнии в живых осталось лишь семь особей. В результате электрофоретического анализа было установлено, что два из них были гибридами с C. betuloides и, таким образом, реинтродукции подлежали лишь пять оставшихся особей. При выращивании Sequoiadendron giganteum потребовалось удалить сеянцы неизвестного происхождения. Совместный анализ изоферментов взрослых деревьев и подроста позволил легко решить эту задачу.
Изучение древесных растений произрастающих на техногенных территориях с помощью изоферментных маркеров проводилось так же в Башкирском Зауралье. Исследования проводились на отвалах Учалинского горно-обогатительного комбината и Башкирского медно-серного комбината, расположенного в г. Сибае. В итоге были выявлены сходство и различия пространственной структуры подроста сосны обыкновенной и березы повислой при лесовозобновлении отвалов в степной (БМСК) и лесостепной (УГОК) зонах. Отвальные породы относительно пригодны для лесовозобновления, а исследованные виды способны заселить техногенные территории и демонстрируют успешный рост и развитие. Для искусственной лесной рекультивации в степной зоне необходима посадка на отвалах деревьев, которые с достижением репродуктивного возраста станут существенным источниками семян (семенниками). На техногенных землях в лесостепной зоне вблизи УГОК древесные растения способны естественным образом обеспечить рекультивацию отвалов, воспроизводя генофонд природных популяций.
2. Электрофорез
В общем, термин электрофорез определяется как «миграция заряженных частиц под действием электрического поля». Метод разделения белков электрофорезом был предложен А. в 1937году. Этот "метод движущейся границы" предполагал разделение белков в растворе. Смитис впервые получил крахмальный гель и предложил его использование в качестве матрицы для «зонного электрофореза», успешно существующего и поныне метода разделения. При зонном электрофорезе молекулы разделяются на дискретные зоны в стабильной среде". Вскоре Дж. Кон сообщил об использовании целлюлозно-ацетатного геля как среде для электрофореза, а через два года две группы экспериментаторов описали электрофорез в полиакриламидном геле. До настоящего времени эти три электрофоретических среды продолжают широко использоваться для разделения белков, при этом каждая имеет свои особенности и соответствующий спектр применений.
2.1. Преимущества и недостатки использования полиакриламидного геля как электрофоретической среды.
Среди всех электрофоретических сред (электрофорез в геле из ацетата целлюлозы, крахмальный гель) полиакриламидный гель (ПААГ), обладая эффектом так называемого "молекулярного сита", т. е. разделения белков по размеру, обеспечивает оптимальное разрешение. Поры этого геля соизмеримы по размеру с белковой молекулой. Для того чтобы разделить сходные по заряду молекулы можно варьировать структурой геля и добиться максимального эффекта просеивания. Гели имеют относительно прочную структуру, прозрачны и поэтому удобны для денситометрических измерений. Считается, что ПААГ - лучшая среда для разделения неферментных белков или фрагментов ДНК, тогда как при разделении ферментов различные компоненты полиакриламидного геля, например, персульфат аммония могут ингибировать ферменты и вызывать артефакты.
Недостаток метода - это невозможность разрезать гель более, чем на 2 слоя, что сокращает продуктивность анализа. При электрофорезе в наиболее широко применяемой вертикальной ПААГ-системе можно определять только те ферменты, которые движутся к аноду. Когда для проявления используются "сопрягающие" ферменты с большим молекулярным весом, их молекулы не могут проникнуть в гель используемых обычно концентраций (5-12%). И наконец, акриламид является нейротоксином, поэтому, необходимо осторожно обращаться с его порошком или раствором; после полимеризации токсичность его существенно уменьшается.
Несмотря на токсичность, синтезированные из акриламида гели обеспечивают лучшую (по сравнению с крахмалом, например) высокую воспроизводимость результатов, так как гель по линейным размерам гомогенен, прозрачен, поддается очистке за счет перекристаллизации, дает высокое разрешение полос
2.2. Принципы электрофоретического разделения.
Относительная подвижность молекул в большинстве электрофоретических сред зависит от трех параметров: суммарного заряда молекулы, ее молекулярного веса и сворачивания полипептидной цепи в белковую глобулу. Даже одинаково заряженные молекулы могут разделяться по массе и/или конформации (эффект молекулярного сита). Молекулы одинакового веса могут быть разделены по заряду в случае замены кислой аминокислоты на нейтральную, нейтральной на основную, основной на кислую и т. д. У большинства водорастворимых белков достаточно высокая степень полиморфизма.
При анализе изображения зимограммы для мономерного (состоящего из одной субъединицы) и димерного (из двух субъединиц) ферментов, характер спектра говорит о монолокусном контроле, во втором случае - о дилокусном. Подобные множественные формы ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию, называют изоферментами, или изозимами. Изозимы, кодируемые аллелями одного и того же локуса, называются иллозимами.
Электрофорез начинается, когда прилагается электрическое поле. Соотношение напряжение / ток зависит при этом от типа используемой буферной системы, разведения буфера и размеров геля. Значения напряжения выбираются обычно в диапазоне В, что соответствует току вмА. Чем больше ток, тем лучше напряжение, однако высокий ток нагревает гель, что ухудшает активность ферментов и качество разделения. Поэтому необходимо поддерживать наибольшие характеристики поля, допустимые при низкой постоянной температуре. Это достигается применением активных систем охлаждения (криостатов) или помещением геля в холодильник перед нанесением проб и на все время разгонки, а также помещением хладоэлементов на поверхность геля. Время электрофореза зависит от прикладываемого напряжения и скорости миграции ("подвижности") ферментов в используемой буферной системе.
2.3. Электрофоретический эксперимент.
2.3.1. Оборудование
Примерный список оборудования, в разной степени необходимого для организации электрофоретической лаборатории.
Общее оборудование
Морозильники (от -20°С до -80°С), холодильники (+4°С)
Системы активного охлаждения
Источники питания постоянного тока (2-4 шт)
Дистиллятор
Лабораторные весы (г, точность 1-10 мг)
Центрифуга с охлаждением
Магнитные мешалки (3-6 шт)
Автоматические пипетки - микродозаторы мкл, 2-4 шт)
Диспенсеры (для компонентов окрасочных растворов)
Специальное оборудование
Электрофоретические камеры (2-8 шт)
Кюветы для окрашивания (10-30 шт.)
Столик с уровнем (для приготовления гелей)
Пластиковые гребенки (для создания в геле лунок для нанесения образцов)
Лабораторная посуда
Конические колбы (мл, шт.)
Лабораторные стаканы или мензуры (100 мл - 10-25 шт., 200-300 мл - 5-8 шт., 400-600 мл)
Темные бутыли и пузырьки для хранения растворов (50-5000 мл, 20-30 шт.)
Пипетки (1-10 мл, 10-30 шт.) Лабораторные термометры
Расходные материалы
Наконечники для микродозаторов
Пластиковые пробирки (1.5 и 0.6 мл)
Фильтровальная бумага
Бумажные салфетки
Прочее
Ножницы, шпатели, пинцеты, скальпели и пр.
Ступки с пестиками для гомогенизации тканей или гомогенизаторы различных систем
Защитные латексные перчатки
Сумки-холодильники для сбора материала в полевых условиях
Охлаждающие элементы для стабилизации температуры гелей во время разгонки
Системы графической регистрации изображений
Цифровой фотоаппарат или сканер или компьютерная видеосистема перехвата изображений Денситометр
Компьютер для хранения и обработки данных.
2.3.2. Реактивы
Список реактивов, применяемых в изоферментном анализе.
Acetic acid | Уксусная кислота
|
Acetone | Ацетон
|
Glucose | Глюкоза
|
Fast Black K Salt | Прочный черный К соль
|
Fast Blue BB Salt | Прочный синий ВВ соль |
Maleic acid | Малеиновая кислота
|
Polyvinylpirrolidone | Поливинилпирролидон
|
Shikimic acid | Шикимовая кислота
|
Sucrose | Сахароза
|
6-Phosphogluconic acid | 6-фосфоглюконовая Кислота
|
L-Aspartic acid | L-Аспарагиновая кислота |
Thiazolyl Blue tetrazolium bromide | Тиазолий синий тетразолий бромид (МТТ)
|
NAD-H β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form Disidium salt | β –никотинамидадениндинуклеотид редуцированный, динатриевая соль НАД-Н
|
| L-лейцин-2-нафтиламид гидрохлорид
|
Phenasine metosulfate | Феназинметасульфат – ФМС |
| Диметилсульфоксид
|
| НСТ
|
β-Nicotinamide adenine dinucleotide NAD | β –никотинамидадениндинуклеотид НАД |
α-Ketoglutaric acid | α -Кетоглутаровая кислота |
| Пиридоксаль-5-фосфат
|
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sodium salt NADP | β –никотинамидадениндинуклеотид фосфат, натриевая соль НАДФ |
| 6-фосфоглюконат натрия
|
| Формиат натрия
|
L-Glutamic dehydrogenase | L –глутаматдегидрогеназа |
2,6-dichloroindophenol, Na Salt | 2, 6 дихлориндофенола натриевая соль |
α –Naphthyl acetate | α - Нафтилацетат |
| Малат натрия
|
Spiritus aethylicus | Спирт этиловый |
| β-нафтилфосфат натрия |
L-Leucine - β-naphtylamide, hydrochloride | L-лейцин-β-нафтиламида гидрохлорид |
L-Alanine naphtylamide hydrochloride | L-Аланин-β-нафтиламид гидрохлорид
|
Tetramethylethylenediamine (TEMED)
| Тетраметилэтилендиамин |
| Персульфат аммония
|
Methylenebisacrylamide | Метилен-бис-акриламид
|
Acrylamide | Акриламид |
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 |
