2.3.3. Взятие и хранение образцов.
Типы тканей
Любые ткани могут быть использованы для экстракции ферментов, однако, предпочтительнее брать ткани, содержащие более разнообразные по составу ферменты при большей удельной активности и меньшем содержании веществ, способных ингибировать или повреждать нативные белки. Кроме того, желательно, чтобы ткань была относительно устойчива при хранении, с ней должно быть удобно обращаться и ее должно быть легко гомогенизировать. Например, у растений ферменты могут быть экстрагированы из многих вегетативных (листья, почки, корни) тканей, а также из семян (ткани зародыша и эндосперма). Необходимо принимать во внимание, что некоторые формы ферментов специфически локализованы в определенных тканях и могут быть экстрагированы только из них.
Сбор и хранение
Процесс деградации белков начинается сразу после извлечения ткани или смерти организма, главным образом из-за наличия протеолитических ферментов. Следовательно, для уменьшения деградации ферментов в пробах и ингибирования активности, нужно по возможности сократить время от извлечения ткани или прекращения жизнедеятельности организма до анализа. Оптимальным вариантом было бы анализировать ферменты из свежей ткани, но это не всегда возможно. Большинство тканей можно держать при температуре около +4° С от нескольких часов до нескольких недель, или замораживать при различных температурах, если нужно сохранить их на более долгий период. Нужно, однако, заметить, что несколько циклов замораживания - оттаивания как правило, резко снижают или полностью подавляют активность некоторых ферментов. Чувствительность и связанные с ней режимы хранения образцов и его максимально возможный срок неодинаковы для разных ферментов из разных тканей различных организмов.
Экстракция ферментов
Экстракция для тканей семян состоит в добавлении к свежей или замороженной ткани определенного объема экстрагирующего буфера и легкой механической гомогенизации для разрушения клеточных стенок и освобождения ферментов. Вегетативные ткани, особенно у многолетников, богаты вторичными метаболитами, полифенолами, хинонами, смолам и т. п., которые часто ингибируют ферменты. В этом случае в экстрагирующую смесь вводят компоненты - протекторы белков. Наиболее часто используются поливинилпирролидон (PVP), полиэтиленгликоль, бета-меркаптоэтанол и некоторые другие. В старых тканях больше концентрация вторичных метаболитов, и поэтому для нейтрализации их вредного влияния на белки чаще используют сложные буфера с веществами-протекторами.
Для того, чтобы избежать перегрева образцов во время экстракции, и особенно если применяется интенсивное растирание с выделением тепла в результате трения, экстрагирующий буфер предварительно охлаждают.
2.3.4. Подготовка растворов.
Экстрагирующий буфер.
Из расчета: 20 мл 0.5 М Трис-HCl, добавить 60 мл ДВ и 20 г сахарозы, растворить, добавить 0.5 мл 2-mercaptoethanole, довести объем до 100 мл ДВ.
Электродный буфер.
Взвесить глицин 28.8 г, добавить 850 мл ДВ, при помощи крепкого раствора Триса повысить рН до 8.3, довести объем точно до 1 л. Перед употреблением раствор разбавляется в 10 раз.
0.5 М Трис-HCl буфер, рН 8.0.
Взвесить Трис 60.5 г, добавить 850 мл ДВ, при помощи HCI рН раствора снизить до 8.0, довести объем точно до 1 л. Для окрашивания берется 20 мл и ДВ доводится до 100 мл.
0.5 М Ацетатный буфер, рН 5.4.
Поставить Взвесить ацетат натрия 95,16 г, добавить 900 мл ДВ, при помощи HCl снизить до 5.4, довести объем точно до 1 л.
0.5 М Трис-малеатный буфер.
Поставить стакан на 1000 мл на весы, обнулить. Взвесить 58,04 г малеиновой кислоты (С4Н4О4), положить красную мешалку. Убрать стакан на стол, добавить 850 мл ДВ, при помощи крепкого раствора Триса снизить до 8.0, довести объем точно до 1 л.
Крепкий раствор Триса.
Растворить в стакане с ДВ на 100 мл до насыщения трис, перелить во флакон и закрыть. Можно хранить несколько месяцев.
Раствор № 1.
Взвесить Трис 91,5 г, добавить 200 мл ДВ, добавить ТЭМЭД 0.58 мл, добавить 200 мл ДВ, рН раствора снизить до 8.9, довести объем точно до 500 мл. Раствор может храниться в холодильнике до 1-2 месяцев.
Раствор № 2.
Взвесить метиленбисакриламид 4 г, добавить акриламид 150 г, добавить 350 мл ДВ, довести объем точно до 500 мл.
Раствор № 5.
Взвесить Трис 28.5 г, добавить 400 мл ДВ, добавить ТЭМЭД 2.3 мл автоматической пипеткой и контролировать вес на электронных весах, растворить на мешалке, при помощи HCI рН раствора снизить до 6.9, довести объем точно до 500 мл.
Раствор № 6.
Взвесить метиленбисакриламид 12.5 г., добавить акриламид 50.0 г. Довести объем точно до 500 мл.
Раствор персульфата аммония.
Для ВГ и НГ двух блоков нужны 26+64 мл. Взвесить персульфата аммония 140 мг (0.14 г), добавить 100 мл ДВ.
2.3.5. Сбор блоков (камер) и подготовка гелей.
Приготовить 5 пластин разных размеров шириной 8-14 см и длиной 30см, толщиной 5мм: три одинаковых, одно самое широкое, одно самое длинное. Приготовить прокладки (толщиной 0,4-1,5 мм при ширине 10-15 мм), шнуры длинные и короткие и основной корпус блока.
С маленькой стороны основного корпуса блока длинным шнуром необходимо закрепить самое толстое стекло, перевернуть корпус. Далее нужно установить прокладки с двух сторон пластин и положить следующую пластину, так же прокладки по краям, третье стекло, опять прокладки и последнее одинаковое стекло. Последними прокладками нужно закрепить самое большое стекло и с наружной части затыкается сначала двумя короткими шнурами, в конце самым длинным шнуром. Стекла должны плотно прилегать к прокладкам. Шнуры должны по углам образовывать прямой угол и по всей длине не впадать слишком глубоко.
Заливка нижнего геля.
На два блока необходимо использовать 128 мл жидкого геля. Отлить 32 мл р-ра № 1 в стакан на 200 мл с магнитиком. Прилить туда же 32 мл р-ра № 2 и 64 мл р-ра ПСА, перемешивать на мешалке несколько минут без «завихрения». Если перемешивать мало, гель будет неоднородным, если долго – вы можете не успеть залить.
Блок держать при заливке под углом (в трехмерном пространстве), чтобы заливающийся гель вытеснял воздух. Заливать до уровня, чтобы осталось место 3-4 см для верхнего геля. Вставить полоски фильтровальной бумаги на разных уровнях, осторожно (не смешивая с гелем) залить гель ДВ несколько мм (много нальете – буфер разбавится, если мало – гель не накроется ДВ). Об окончании полимеризации свидетельствует появление резкой границы между ДВ и гелем.
Заливка верхнего геля.
Готовить ВГ из расчета на 2 блока. Из 0.14 %-ного р-ра ПСА отлить в стакан (на 100 мл) 26 мл, поставить на весы, обнулить вес, добавить 12.8 г сахарозы, довести объем до 66 мл, добавить 22 мл р-ра № 4 (буфер с рН 6.9) и 44 мл р-ра № 5. Перемешивать на мешалке несколько минут, без «завихрения».
Гребешки подобрать так, чтобы все они входили между стеклами. Залить в блок до верхней кромки стекол, вставить гребешки (следить, чтобы под ними не осталось пузырьков, чтобы между зубьями гребешка не было воздуха). Об окончании полимеризации свидетельствует «линия между гелем и зубьями» (обычно через 10-15 минут) и появление «молочности» геля.
Если готовы образцы, вынимаем первый гребешок, с лунки удаляем шприцем (с одного из углов) не заполимеризовавшийся р-р, не протыкая дна лунок. Повторяем операцию для всех гелей. В конце удаляем жидкость с крайних карманов, заполняющиеся снова.
2.3.6. Подготовка и нанесение образцов.
Подготовить ступки и пестики, пробирки в штативах (пронумеровав их и отмечая в журнале, под каким номером какие образцы и с какой лунки идет отсчет). Во все из них предварительно добавить поливинилполипиролидон (ПВП) в таком количестве, чтобы гомогенат был густым (для увеличения концентрации белка), но после центрифугирования осталось достаточно надосадочной жидкости (по 8 ферментам 2 блоков - около 350 мкл или по 35-40 на фермент.
Растения перед растиранием нужно промыть от загрязнений в ДВ, подсушив фильтровальной бумагой. Для получения экстрактов из растительных тканей нужно тщательно растереть в ступках при помощи пестиков до образования однородной массы с экстрагирующего буфера. Переместить эту массу в эппендорфы, центрифугировать несколько минут, перелить в другие пробирки надосадочную жидкость, держать не более 1 дня в холодильнике.
В карман от гребешка осторожно наслоить около 35 мкл образца (в некоторых случаях, например, на MDH, требуется меньший объем). После нанесения всех образцов необходимо наслоить поверх образцов с одного угла геля холодный электродный буфер. После этого осторожно снять с задней части геля длинную резинку (поставленную для предотвращения вытекания геля, когда он еще жидкий).
2.3.7. Окрашивание.
С помощью изоферментного анализа можно выявить индивидуальные ферменты после электрофореза водных гомогенатов тканей, представляющих собой сложные смеси белков. Гистохимическое окрашивание - это сопряжение реакции, катализируемой тем и иным ферментом, с одним из методов визуализации, обычно трансформацией растворимого красителя в нерастворимую форму с изменением цвета. Полосы, которые образуются в местах выпадения из раствора красителя, маркируют место нахождения фермента в геле.
Зоны ферментативной активности формируются при воздействии красящего раствора на гель с образцами после электрофореза. (Всего описано более 200 протоколов для выявления различных ферментов).
Существует некоторые общие правила при приготовлении и применении красящих растворов. Так как многие компоненты красящих растворов нестабильны или чувствительны к свету их обычно готовят непосредственно перед употреблением. Растворы некоторых стабильных реактивов могут быть приготовлены заранее. Это может существенно сократить время на окраску. Таким образом могут быть приготовлены субстраты, закисляющих раствор (например, яблочная, глутаминовая кислоты), которые при этом нейтрализуются. В растворах могут храниться обычно и красители (МТТ, НСТ и некоторые другие), ФМС, а также иногда коферменты НАД, НАДФ. (ВНИМАНИЕ!!! Многие компоненты окрасочных смесей являются мутагенам канцерогенами или ядами. Не вдыхайте порошки, избегайте контакта с реактивами кожи глаз. Рекомендуется носить латексные перчатки. Опасные для здоровья реактивы соответствующим образом маркируются производителем.)
Прописи для окрашивания.
Аланинаминопептидаза
Alanine aminopeptidase (AAP)
В стакан на 200 мл налить 2 бюкса 0.5 М трис-малеатного буфера (рН 5,4) и 180 мл ДВ. Гель положить в кювету, залить 100 мл полученного раствора.
Через 15 минут вымачивания во вторую половину буфера в 100 мл прилить раствор отфильтрованной К соли (50 мг, 20 мл ДВ) и навеску аланин-2-нафтиламид…(30 мг). Слить из кюветы буфер, залить приготовленный раствор.
Аспартатаминотрансфераза
Aspartate aminotransferase (AAT)
Заранее в стакан на 200 мл налить 1 бюкс трис-НСl и 80 мл ДВ, 5 мл концентрированного ААТ субстрата, 0.1 г oxo(или keto-)glutaric acid. За 5-10 минут до окрашивания 50 мu ВВ соли растворить в 10 мл ДВ, отфильтровать. Гель положить в 100 мл приготовленного буфера, через 1-2 минуты прилить ВВ, интенсивно перемешать. Если полосы слабые и не докрасились, после «коричнивения» раствора слить его и использовать другие 100 мл с новой ВВ солью.
Глутаматдегидрогеназа и формиатдегидрогеназа
Glutamate dehydrogenase (GDH, FDH)
Заранее налить в стакан на 100 мл 1 бюкс трис-НСl и 80 мл ДВ. Добавить 0.5 г глутаминовой кислоты, формиат 1.0 г, 20 мг НАД. За 5 минут до окрашивания поставить стакан на мешалку, добавить 15 мг МТТ или его раствор, размешать, за 1 минуту добавить ФМС.
Лейцинаминопептидаза
Leucine aminopeptidase (LAP)
В стакан на 200 мл налить 2 бюкса 0.5 М трис-малеатного буфера (рН 5,4) и 180 мл ДВ. Гель положить в кювету, залить 100 мл полученного раствора. Через 15 минут вымачивания во вторую половину буфера прилить раствор отфильтрованной К соли (50 мг, 20 мл ДВ) и раствор лейцин-2-нафтиламид…(30 мг), в смеси 3 мл ацетона + 3 мл спирта. Слить из кюветы буфер, залить приготовленный раствор.
Для LAP и ААР нужно приготовить общую К соль, (сначала полосы тонкие, но слабые. По мере окрашивания они становятся толстыми и гетерозиготы сливаются. Поэтому зарисовывать нужно в несколько приемов, все время уточняя рисунок.)
Эстераза
Esterase (EST)
Заранее в стакан на 100 мл налить 1 бюкс трис-НСl буфера и 80 мл ДВ. За 5 минут до окрашивания растворить 50 мг нафтилацетата в 5 мл ацетона, залить в буфер медленно при помешивании. Растворить 50 мг ВВ соли в 10 мл ДВ, отфильтровать. Для EST и ААT нужно приготовить общую ВВ соль. Залить гель в кювете без ВВ соли, через 2 минуты добавить ВВ, перемешать. Сначала полосы тонкие, но слабые. По мере окрашивания они становятся толстыми и гетерозиготы сливаются. Поэтому зарисовывать нужно в несколько приемов, все время уточняя рисунок. Не допускать окрашивания до потемнения раствора – он неспецифически окрашивает гель. Если полосы слабые и не докрасились, после «потемнения» раствора слить его и использовать другие 100 мл с новой ВВ солью и субстратом.
Малатдегидрогеназа
Malate dehydrogenase (MDH)
Заранее налить в стакан на 100 мл 1 бюкс трис - НСl и 80 мл ДВ. Добавить 5 мл субстрата МДГ, 20 мг НАД. За 5 минут до окрашивания поставить стакан на мешалку, добавить 15 мг МТТ или его раствор, размешать, за 1 минуту добавить ФМС.
6-фосфоглюконатдегидрогеназа
6-phosphoglukanate dehydrogenase (6-PDH)
Заранее налить в стакан на 200 мл 1 бюкс трис-НСl и 80 мл ДВ. Добавить 20 мг 6-фосфоглюконовой кислоты, 15 мг НАДФ. За 5 минут до окрашивания поставить стакан на мешалку, добавить 15 мг МТТ или его раствор, размешать, за 1 минуту добавить ФМС.
Диафораза
Diaphorase (DIA)
Заранее налить в стакан на 200 мл 1 бюкс трис - НСl и 80 мл ДВ. Добавить 20 мг НАДН. За 5 минут до окрашивания поставить стакан на мешалку добавить 2,6-дихлорфенол…на кончике скальпеля, 15 мг МТТ (размешивать постоянно).
Шикиматдегидрогеназа
Shicimic dehydrogenase (SKDH)
Заранее в стакан налить 1 бюкс трис – НСl, 80 мл ДВ. Добавить 20 мг шикимовой кислоты, 20 мг НАД. За 5 минут до окрашивания поставить стакан на мешалку, добавить 15 мг МТТ или его раствор, размешать, за 1 минуту добавить ФМС.
Флуоресцентная эстераза
Esterase D (EST-D)
Метилумбеллиферил 2 мг растворить в 2 мл ацетона, прилить в 20 мл 0.1М ацетатного (рН 4.7) буфера, перемешать. Гель залить сверху полученным раствором. Просмотреть через 1-2 минуту в маске под УФ светом. Если полосы слабые или их нет, положить обратно в кювету. Через каждые 5 минут просматривать и зарисовывать (белые полосы).
Малик энзим
(ME)
Заранее в стакан налить 1 бюкс трис - НСl и 80 мл ДВ, 5 мл конц. субстрата МДГ 20 мг НАД. За 5 минут до окрашивания поставить стакан на мешалку, добавить 15 мг МТТ, за 1 минуту ФМС.
Литература
1. , , О популяционном подходе в лесоводстве // Лесоведение. – 1988. - № 1. – С. 3-9.
2. , , Белоконь полиморфизма аллозимов и ДНК хвойных: методическое пособие.- Москва: Изд-во , 2011 г. – 53с.
3. Anonymus R. Entschliebung des Bundesrates uber Mabnahmen zur Erhaltung der genetischen Vielfalt der Waldbaumarten // Forst - und Holzw- S. 235.
4. Beim A., Rechenmacher A. Erhaltungssamenplantagen bei Tanne aus immissionsgeschadigten Herkunften // Forst - und HolzwV.40. - P. 247-248.
5. DeHayes D. H., Hawley G. J. Genetic implications in the decline of red spruce // Water. Air and Soil PollutV. 62. – N. 3-4. - P. 233-248.
6. Frohlich H.-J. Welche Folgerungen ergeben sich aus der Immissionsbelastung der Walder fur die Waldwirtschaft in Hessen? // Forst - und Holzw– V. 40. - S. .
7. Goncharenko et al. Genetic resources of pine, spruce and fir species in the former Soviet Union: analysis of their genepools, phylogenetic relationships and genome organization // Sustainable forest genetic resources programmes in the Newly Independent States of the former USSR. Proceedings of a workshop, 23-26 September 1996, Belovezha, Belarus (Goncharenko G. G., Turok T., Gass T and Paule L., eds). Copublished by Arbora Publishers, Zvolen, Slovakia and International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy
8. Gregorius H.-R. The attribution of phenotypic variation to genetic or environmental variation in ecological studies // Genetic Effects of Air Pollutants in Forest Tree Populations / F. Scholz, H.-R. Gregorius, *****din (Eds.). - Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1989. - P. 3-15.
9. Gregorius H.-R. The importance of genetic multiplicity for tolerance of atmospheric pollution // Genetic effects of air pollutants in forest tree populations. Proceedings of the joint meeting of the IUFRO working parties (Grosshansdorf, August 3-7, 1987). – Springer-Varlag Berlin Heidelberg, 1989. - P. 163-172.
10. Hertel H., Zaspel I. Investigations on vitality and genetic structure in oak stands // Ann. Sci. ForV. 53. - P. 761-773.
11. Kleinschmit J. Moglichkeiten der Zuchtung resistenter Waldbaume fur immissionsbelasteten Flachen // Der Forst - und Holzwirt– V. 38. – N. 8. - S. 196-199.
12. Kleinschmit J. R.G., Bacilieri R., Kremer A., Rolof parision of morphological and genetic traits of pendeculate ouk (Q. robur L.) and sessile oak (Q. petraea (Matt.) Liebl.) // Silvae GeneticaV. 44. - P. 256-269.
13. Kremer A., Petit R. J. Gene diversity in natural populations of oak species // Ann. Sci. ForV. 50. Suppl. 1. - P. 186-202.
14. Mattila A., Pakkanen A., Vakkari P., Raisio J. Genetic variation in english oak (Quercus robur L.) in Finland // Silva FennicaV. 28. - P. 251-256.
15. Melchior G. H., Muhs H.-J., Stephan B. R. Erhaltung forstlicher Genressourcen // Allgem. Forstzeitschr– V. 41. - S. .
16. Millar C. I., Westfall R. D. Allozyme markers in forest genetic conservation // New forestsV. 6. - P. 347-371.
17. Muller-Starck G. Protection of genetic variability in forest trees // Forest Genetics– N. 2(3). - P. 121-124.
18. Muller-Starck G., Ziehe M. Genetic variation in populations of Fagus sylvatica L., Quercus robur L., and Q. petraea Liebl. in Germany// Genetic variation in European populations of forest trees (G. Muller-Starck and M. Ziehe (eds.)). Frankfurt am Main: Sauerlander’s Verlag, 1991. - Р. 125-140.
19. Reiseberg L. H. Saving California’s rarest tree // Center for plant Conservation Newsletter.– 1988. – V. 3. – P. 1-8.
20. Samuel R., Pinsker W., Ehrendorf F. Electrophoretiс analysis of genetic variation within and between populations of Quercus cerris, Q. pubescens, Q. petraea and Q. robur (Fagaceae) from eastern Austria // Bot. ActaV. 108. - P. 290-299.
Учебное пособие
Юлай Аглямович Янбаев
Альбина Алековна Музафарова
Айгуль Айдаровна Габитова
Изоферментные маркеры и полиакриламидный диск-электрофореза в решении фундаментальных и прикладных задач лесной генетики и селекции.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 |
