Изоферментные маркеры и полиакриламидный диск-электрофореза в решении фундаментальных и прикладных задач лесной генетики и селекции (стр. 1 )

министерство сельского хозяйства Российской Федерации

Федеральное государственное БЮДЖЕТНОЕ образовательное учреждение высшего профессионального образования «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Изоферментные маркеры и полиакриламидный диск-электрофореза в решении фундаментальных и прикладных задач лесной генетики и селекции.

Учебное пособие

Уфа 2011

УДК

ББК

, ,

Изоферментные маркеры и полиакриламидный диск-электрофореза в решении фундаментальных и прикладных задач лесной генетики и селекции.

В данном учебном пособии описан метод полиакриламидного диск-электрофореза, применяемого для выявления изоферментных маркеров, которые широко используются при изучении генетической изменчивости живых организмов и являются эффективным средством сохранения разнообразия популяций. В первой части рассматривается основы изоферментного анализа и его успешное применение в практике. Вторая часть посвящена непосредственно электрофоретическому эксперименту. В издании последовательно описаны все этапы проведения методики.

Учебное пособие адресовано студентам, аспирантам и молодым ученым желающим освоить данный метод.

, , 2011г.

Издательство

Научное издание

Юлай Аглямович Янбаев, Альбина Алековна Музафарова, Айгуль Айдаровна Габитова

Изоферментные маркеры и полиакриламидный диск-электрофореза в решении фундаментальных и прикладных задач лесной генетики и селекции.

ISBN ©

Содержание

Введение……………………………………………………………………………………………………………	2
1.	Изоферментный анализ…………………………………………………………………………………….
2.	Электрофорез………………………………………………………………………………………………..
	2.1.	Преимущества и недостатки использования полиакриламидного геля как электрофоретической среды………………………………………………………………………..
	2.2	Принципы электрофоретического разделения…………………………………………………..
	2.3	Электрофоретический эксперимент……………………………………………………………….
		2.3.1.	Оборудование…………………………………………………………………………………
		2.3.2.	Реактивы………………………………………………………………………………………
		2.3.3.	Взятие и хранение образцов…………………………………………………………………
		2.3.4.	Подготовка растворов………………………………………………………………………..
		2.3.5.	Сбор блоков (камер) и подготовка гелей…………………………………………………
		2.3.6.	Подготовка и нанесение образцов………………………………………………………….
		2.3.7.	Окрашивание………………………………………………………………………………….
Литература………………………………………………………………………………………………………..

Введение

Данное методическое руководство необходимо для ознакомления студентов высших учебных заведений, обучающихся по сельскохозяйственным, лесотехническим и другим дисциплинам, с методом изоферментного анализа для целей изучения, паспортизации и сохранения генофондов растений и животных. Так же является актуальным практическое ознакомление с методикой не только студентов, но и аспирантов, и молодых сотрудников профильных ВУЗов, академических институтов.

1. Изоферментный анализ.

Изоферментный анализ - это электрофоретическое разделение белков с гистохимическим обнаружением специфической ферментативной активности. Изоферменты – разные формы одного и того же фермента. Биосинтез ферментов контролируется генетически. Если ген полиморфен – изменчивы и изоферменты по своим свойствам (например, по электрическому заряду). По этой причине они являются молекулярными маркерами, позволяющими описывать структуру популяций и их разнообразие. (Рис.1.)

Рис.1. Разделение изоферментных маркеров локусов Lap-1 и Lap-2 в полиакриламидном геле.

(Гистохимическое выявление ферментов двух генов (локусов), кодирующих синтез одного и того же фермента – лейцинаминопептидазы. У изоферментов локуса Lap-2 гетерозиготами являются особь № 4, в Lap-1 - № 7. Таким образом, изучая разные локусы, определяются использованные популяционные параметры: гетерозиготность, число аллелей на локус, доля полиморфных локусов и т. д.)

Электрофоретический спектр, состоящий из полос, называется электрофореграммой, или, в случае изоферментного анализа - зимограммой. На раннем этапе развития электрофореза анализ фореграмм состоял преимущественно в подсчете числа полос и измерении их подвижностей. В дальнейшем быстрое развитие биохимической генетики позволило выявить генетические особенности наблюдаемой изменчивости спектров. Стало очевидным, что большая часть зон активности ферментов на геле контролируются отдельными генетическими локусами, а варианты в пределах зоны - аллелями этих локусов.

Изоферментный анализ успешно используется с конца 50-х годов 20 века как эффективный инструмент во многих сферах генетических исследований. Изоферменты являются на сегодняшний день очень полезными генетическими маркерами, несмотря на быстрое развитие методов анализа ДНК. С помощью изоферментов можно получать надежную и полную генетическую информацию за короткое время. По сравнению с морфологическими признаками проявление электрофоретической изменчивости, не зависит от условий среды, отражает различия непосредственно в генотипах особей. При неправильном условии хранения образцов или пост­трансляционных модификаций, как правило, различия в электрофоретический спектрах легко отличимы от генетической изменчивости путем проверки простых гипотез о типе наследовании. Изоферменты контролируются моногенно (один ген - одна зона ферментативной активности на геле), т. е. демонстрируют простое Менделеевское наследование. Типы наследования обычно проверяются в скрещиваниях, однако в настоящее время наследование изоферментов уже описано у многих таксонов. При анализе нового организма часто нет необходимости проводить скрещивания, поскольку данные по близкородственным видам дают достаточно надежную информацию о наследовании. Важным качеством изоферментных локусов является то, что они экспрессируются кодоминантно, так что в подавляющем большинстве случаев легко диагностируются все генотипы, как гомозиготные, так и гетерозиготные.

Начиная со второй половины ХХ века, значительные усилия исследователей были направлены на выявление специфических механизмов адаптации растений к техногенным факторам. Благодаря прогрессу молекулярно-биологических методов анализа стало возможным изучать проблемы устойчивости на генетическом уровне.

В настоящее время разрабатываются теоретические положения, в основе которых лежит понимание, что для адаптации к нестабильным условиям среды необходимо предотвратить уменьшение биоразнообразия растений и главным образом, на популяционном уровне (Anonymus,1985; Behm, Rechenmacher, 1985; Frohlich,1985; Kleinschmit, 1983, 1985; Melchior et al., 1986; Gregorius, 1989 и др.). Особый упор в экспериментальных исследованиях делается на изучение разнообразия популяций, а не устойчивости отдельных клонов или генотипов к поллютантам. При этом в качестве отправной точки используется идея, что чем выше разнообразие, тем больше у популяции шансов для выживания в постоянно меняющихся условиях окружающей среды (Tigerstedt, 1984).

В качестве примера можно привести работу (De Hayes, Hawley, 1992). В статье рассматривается генетический аспект гибели ели красной (Picea rubens). Причиной ее гибели в условиях загрязнения среды могло быть отсутствие возможностей для адаптации к новым условиям ввиду небольшого уровня генетического разнообразия. Выявлено, что изменчивость популяций этого вида ели гораздо ниже, чем у других древесных пород умеренной зоны, испытывающих то же давление отбора. Авторы отмечают, что более гетерозиготные особи имеют больше шансов выжить и создать жизнеспособную популяцию.

Одним из главных приложений применения изоферментов является оценка экологического потенциала видов. Колонизация новых, гетерогенных во времени и в пространстве, территорий требует наличия популяционной множественности. Как правило, у лесных древесных пород выявляется большая внутрипопуляционная гетерогенность. Необходимость в высоком уровне полиморфизма обусловлена двумя свойствами лесных пород – длительным сроком жизни (уменьшающим возможность адаптации за счет быстрой ротации поколений) и неспособность особей к перемещению в оптимальные условия среды (Gregorius, 1989).

Так же (Muller-Stark, 1995) было проведено сравнение уровня изменчивости европейских древесных видов (7 родов) с недревесными растениями. Значения средней гетерозиготности и числа аллелей на локус у первых были значительно выше (Н = 23.4 – 25.1 и А = 2.2 – 2.7 против Н = 11.3 – 16.5 и А = 1.4). В целом, у долгоживущих древесных выявлено 2.22 аллеля на локус, уровень гетерозиготности составил 17.7 % (Hamrick et al., 1992). Большое аллельное разнообразие позволяет популяциям древесных формировать намного большее число (комбинации) уникальных многолокусных генотипов.