Некоторые аспекты аллергической реактивности и возможности их коррекции у больных с сндромом «Сухого глаза» (стр. 1 )

На правах рукописи

БЕЛЯМОВА

Анна Федоровна

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ КОРРЕКЦИИ У БОЛЬНЫХ С СНДРОМОМ «СУХОГО ГЛАЗА».

14.01.07 – глазные болезни

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Cанкт – Петербург

2011 Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения

и социального развития России.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

БРЖЕСКИЙ Владимир Всеволодович

доктор медицинских наук, профессор

КАЛИНИНА Наталия Михайловна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

АЛЕКСЕЕВ Владимир Николаевич

доктор медицинских наук, профессор

БУБНОВА Людмила Николаевна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. » Министерства здравоохранения и социального развития России.

Защита состоится « 28 » ноября 2011 года в 14 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.09 при ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академии имени » МО РФ ( Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО «Военно-Медицинская академия им. » МО РФ.

Автореферат разослан " " октября 2011 года.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор медицинских наук

КУЛИКОВ Алексей Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность. В последние годы все большее внимание широкого круга специалистов привлекает синдром «сухого глаза» (ССГ). Длительное время это заболевание связывали только с болезнью Съегрена. Однако частота возникновения ССГ значительна и имеет тенденцию к увеличению. Так, по данным R. Marquardt и F.H. Wenz, в 1980 году ССГ выявляли у 30% пациентов, впервые обратившихся к офтальмологу. По сведениям же , в 2002 году ССГ диагностировали уже у 40% пациентов офтальмологического профиля, а в 2003 году (по данным и ) – у 45%.

Развитию ССГ способствует увеличение спектра повреждающих факторов: работа с компьютерными мониторами; использование в офисных помещениях и в автомобиле кондиционеров; внедрение и широкое распространение новых методов кераторефракционной хирургии; применение средств контактной коррекции зрения. В настоящее время используется клиническая классификация ССГ, учитывающая его патогенез и этиологию, разработаны и активно применяются методы ранней диагностики и лечения этого синдрома (, , 1998). Несмотря на то, что ССГ свойственен преимущественно людям пожилого возраста, заболевание нередко развивается и у молодых людей. Как правило, клиническая картина ССГ у них характерна либо для артефициального «компьютерного» синдрома, либо признаки ксероза глазной поверхности сочетаются с симптомами хронического аллергического конъюнктивита. Это обстоятельство требует изучения патогенеза и совершенствования дифференциальной диагностики этих клинических форм синдрома «сухого глаза». В частности, до настоящего времени не разработан алгоритм диагностики ксеротических изменений глаз у пациентов с аллергическими изменениями конъюнктивы, равно как и алгоритм диагностики аллергических изменений конъюнктивы у больных с ССГ. При этом остается нерешенным вопрос и о тактике лечебных мероприятий в отношении больных с ССГ, сочетанным с хроническим аллергическим конъюнктивитом.

Высокая частота встречаемости синдрома «сухого глаза», ассоциированного с хроническим аллергическим конъюнктивитом, необходимость дифференцированного подхода к диагностическим и лечебным мероприятиям в отношении этих пациентов и определили важность исследования их местной и системной иммунологической реактивности, а также возможностей ее коррекции.

Указанные выше обстоятельства и явились побудительным мотивом к выполнению данного исследования.

Цель работы:

На основании комплексного клинико-функционального, лабораторного, аллергологического и иммунологического обследования изучить особенности иммунологической реактивности и выявить возможности ее коррекции у пациентов с артефициальным, а также ассоциированным с хроническим аллергическим конъюнктивитом, синдромом «сухого глаза».

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Определить рациональный перечень методов лабораторного обследования, ориентированного на исследование иммунологической реактивности при ССГ.

2. Изучить характер иммунологической реактивности при артефициальном синдроме «сухого глаза», а также при ССГ, ассоциированном с хроническим аллергическим конъюнктивитом.

3. Изучить взаимозависимость параметров, характеризующих клиническое течение ксероза и состояние иммунологической реактивности у больных с ССГ.

4. Оценить эффективность терапевтических мероприятий в отношении пациентов с ССГ, с учетом коррекции их аллергических проявлений.

Научная новизна:

На основании изучения параметров местного и системного иммунитета расширено представление о патогенезе синдрома «сухого глаза», ассоциированного с аллергическими изменениями конъюнктивы, а также артефициального ССГ, развившегося на фоне компьютерного синдрома.

Выявлена зависимость между тяжестью клинических проявлений ксероза глазной поверхности и выраженностью нарушений параметров иммунитета у пациентов с ССГ, ассоциированным с хроническим аллергическим конъюнктивитом.

Определены последовательность и объем диагностических и лечебных мероприятий, осуществляемый больным с синдромом «сухого глаза», ассоциированным с аллергическими изменениями конъюнктивы и артефициальным ССГ.

Модифицирован метод импрессионной цитологии конъюнктивы, получен патент на изобретение «Способ подготовки клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию» № 000 от 01.01.2001.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Одновременное определение параметров иммунологической реактивности в слезной жидкости и крови позволяют дифференцировать артефициальный ССГ, развившийся на фоне компьютерного синдрома и ССГ, ассоциированный с хроническим аллергическим конъюнктивитом.

2. Наличие персистирующего хронического аллергического конъюнктивита является показанием для целенаправленного обследования пациента на наличие синдрома «сухого глаза».

3. Применение противоаллергических препаратов эффективно в комплексном лечении пациентов с ССГ, ассоциированным с хроническим аллергическим конъюнктивитом.

4. Усовершенствованный, неинвазивный способ подготовки клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию с помощью МКЛ позволяет существенно упростить методику импрессионной цитологии.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Теоретическая значимость проведенного исследования состоит в том, что доказана зависимость проявлений ССГ от типа иммунологической реактивности. Охарактеризованы, с учетом полученных сведений, этиопатогенетические особенности формирования ССГ, в том числе при его сочетании с аллергическим конъюнктивитом.

При ССГ, ассоциированным с хроническим аллергическим конъюнктивитом, в слезной жидкости выявлено увеличение уровня IL – 4 и IgE, соответственно в 1,7 и 2,0 раза, в сыворотке крови – снижение содержания IL – 4 и IL – 6, соответственно, в 2,6 и 1,5 раза, а также увеличение концентрации IgE в 17,9 раз, по сравнению с контрольной группой.

При артефициальном ССГ в слезной жидкости обнаружено снижение уровня IL – 4 и TNF – a, соответственно, в 1,4 и 2,0 раза, увеличение концентрации IgE в 2,0 раза; а в сыворотке крови – увеличение содержания IL – 4 и IgE в 1,6 и 3,1 раза, соответственно, и уменьшение уровня IL – 6 в 2,0 раза, по сравнению с контрольной группой.

Результаты проведенного исследования существенно дополняют возможности дифференциальной диагностики между артефициальным ССГ, развившимся на фоне компьютерного синдрома, и ССГ, ассоциированным с хроническим аллергическим конъюнктивитом, а также позволяют назначать патогенетически ориентированную терапию таким пациентам.

Практическая значимость выполненных исследований для врачей-офтальмологов и для клинических иммунологов состоит в том, что разработаны критерии, позволяющие повысить эффективность диагностики и лечения артифициального ССГ, развившегося на фоне компьютерного синдрома, и ССГ, ассоциированного с хроническим аллергическим конъюнктивитом.

Личный вклад автора. Данные, представленные в работе, получены лично автором. Выполнен отбор обследуемых пациентов, сбор цитологического материала и слезной жидкости с использованием модифицированных автором методов. Забор клеток конъюнктивы для цитологического исследования осуществляли по модифицированному, с участием автора, методу. Получен патент на изобретение «Способ подготовки клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию» № 000 от 01.01.2001. Автором лично произведено планирование исследований, сформирована база данных, а также проведена статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: «Объединенный иммунологический форум - 2008» (Санкт – Петербург, Россия 2008); «XIII Всероссийский научный форум с международным участием имени академика » (Санкт – Петербург, Россия 2009); V Всероссийская конференция молодых ученых: «Актуальные проблемы офтальмологии - 2010» (Москва, Россия, 2010); «Конференция, посвященная 75-летию кафедры офтальмологии СПбГПМА» (Санкт – Петербург, Россия 2010).

Внедрение результатов в практику. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно – диагностическую работу кафедры офтальмологии и отделения микрохирургии глаза клиники ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития России; ФГБУ Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины имени МЧС России, а также в лечебно – диагностическую работу СПб ГУЗ «Городская поликлиника № 14».

Получен патент на изобретение «Способ подготовки клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию» № 000 от 01.01.2001.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 8 научных работ, в том числе, 3 статьи - в журналах по перечню ВАК Минобразования и науки Российской Федерации. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает в себя 148 источника, в том числе 40 отечественных и 108 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 38 таблицами, 37 рисунками и 2 схемами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основу для клинических исследований составили 100 пациентов (200 глаз) 25-36 лет офтальмологического профиля, которые были распределены на четыре равные (по 25 человек - 50 глаз) группы: одну контрольную и три экспериментальные. Основную группу – составили больные с клинико-функциональными признаками ССГ и фолликулезом конъюнктивы. Группу сравнения I - с наличием фолликулеза конъюнктивы при отсутствии клинико-функциональных признаков ксероза (ССГ). Группу сравнения II - с клинико-функциональными признаками ССГ при отсутствии фолликулеза конъюнктивы. Контрольную группу составили здоровые люди 24-25 лет – без клинико-функциональных признаков роговично-конъюнктивального ксероза и фолликулеза конъюнктивы и отсутствием в анамнезе аллергических реакций.

Критериями исключения из исследования во всех группах являлись: прием антигистаминных препаратов и β – адреноблокаторов внутрь или в виде инстилляций в конъюнктивальную полость; прием гормональных контрацептивных препаратов.

Средний возраст пациентов основной группы составил 34 ± 2,18 года, пациентов группы сравнения I и II - 30±1,92 и 26±0,92 лет, соответственно, а контрольной группы - 25±0,73 лет. Во всех группах обследованных преобладали женщины, они составляли от 88% до 92%. Участие пациентов в работе являлось добровольным.

Все пациенты были обследованы стандартными офтальмологическими методами, которые включали: визометрию с коррекцией, биомикроскопию с помощью щелевой лампы, офтальмоскопию, тонометрию по Маклакову (после проб по Норну, Ширмера I и II) и, при необходимости, периметрию. При выявлении сопутствующей офтальмологической патологии объем диагностических мероприятий был расширен. Также всем пациентам было произведено иммунологическое исследование слезной жидкости и сыворотки крови; импрессионная цитология клеток конъюнктивы с помощью мягкой контактной линзы и исследования материала соскоба конъюнктивы на предметное стекло. Среди прочих параметров слезной жидкости у обследуемых пациентов определяли уровень цитокинов: IL - 4, IL - 6, TNF – α. Кроме этого определяли количество IgE и sIgA. Методика разработанного нами способа сбора слезной жидкости (с учетом снижения слезопродукции у большинства исследований) состояла в следующем. После местной эпибульбарной анестезии раствором оксипробукаина 0,4% в конъюнктивальную полость из одноразового инсулинового шприца (без иглы) по 1 капле инстиллировали 1,0 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и сразу же стерильной одноразовой пипеткой смывную жидкость собирали в стерильный промаркированный эпендорф. В результате проведенных манипуляций в эпендорфе оказывалось 0,5 мл слезной жидкости («разведенной» в 0,9 % раствора натрия хлорида). Полученный материал до этапа лабораторного исследования хранили в морозильной камере холодильника при температуре -18,0°С. В исследуемых пробах слезной жидкости, методом иммуноферментного анализа (ИФА), проводили исследование уровня цитокинов: IL - 4, IL- 6, TNF – α, а также количества IgE и sIgA. Реакцию ИФА ставили в пластиковых планшетах, на стенках лунок которых адсорбированы моноклональные антитела к исследуемому антигену. Концентрацию анализируемых субстанций в исследуемых образцах определяли по калибровочному графику зависимости оптической плотности от содержания антигена в калибровочных пробах. Интенсивность цветной реакции оценивали на фотометре EL x 800 Universal Mikropate Reader фирмы BIO – TEK INSTRUMENTS INS.

Сразу после сбора слезной жидкости производили цитологическое исследование эпителия бульбарной конъюнктивы методом импрессионной цитологии и традиционной микроскопии материала соскоба. Для реализации метода импрессионной цитологии, для забора клеточного материала вместо дорогостоящего и малодоступного фильтра Millipore VSWP 0,025 mm была использована мягкая контактная линза. В указанных целях мягкая контактная линза (использовали однодневные линзы 1 day ACUVUE, рефракция -3,0; радиус кривизны - 8,5мм) извлекали из блистера и «подсушивали» при комнатной температуре. Затем линзу устанавливали «вогнутой» стороной на тонометр Маклакова весом 10 грамм. Тонометр с МКЛ, как при измерении ВГД, после инстилляционной анестезии 0,4% раствором оксипробукаина, прикладывали к бульбарной конъюнктиве в 2-3 мм над лимбом в меридиане 12 часов на 2-3 секунды. Взор обследуемого в ходе исследования ориентировали книзу. Далее контактную линзу «выворачивали» таким образом, чтобы полученный материал находился на «дне» МКЛ. Производили фиксацию материала на МКЛ, путем ее однократного погружения в 95% этиловый спирт на 10 минут. Затем линзу промывали дистиллированной водой, подсушивали на воздухе, помещали в промаркированный контейнер и микроскопировали по методике, описанной ниже. Для оценки диагностической ценности разработанного нами способа забора материала, после компрессии конъюнктивы контактной линзой, стерильным одноразовым зондом (для каждого глаза использовался «свой» зонд) собирали материал с конъюнктивы глазного яблока в 2-3 мм от лимба в меридиане 12 часов и наносили на промаркированное предметное стекло.

Материал на стекле фиксировали в течение 10 минут 95 % этиловым спиртом, промывали проточной водой и подсушивали на воздухе. Предметные стекла, и контактные линзы с материалом направляли в лабораторию, где производилась окраска и микроскопия полученных препаратов. Материал на контактной линзе окрашивали гематоксилином в течение 10-15 с., промывали дистиллированной водой и подсушивали на воздухе. На предметном стекле - окрашивали гематоксилином в течение 10 минут, промывали проточной водой, затем окрашивали эозином в течение 15 с. и высушивали на воздухе.

Цветовую микроскопию материала на контактных линзах и предметных стеклах производили на микроскопе Leica LEITZ DM RB при увеличении 200 (объектив х 20, окуляр х 10) и фотографировали полученные результаты.

С учетом того, что аллергические заболевания глаз, как правило (в 95%), ассоциированы с другими аллергическими заболеваниями (Brewitt H., Zierhut M., 2001), методом ИФА был проанализирован уровень цитокинов сыворотки крови: IL - 4, IL – 6 и TNF – α, а также определяли уровень IgE и sIgA. Методика сбора крови заключалась в следующем. Из локтевой вены методом самотека получали 5,0 мл крови. «Отстоявшуюся» сыворотку крови (1,0 мл) помещали в промаркированный эпендорф, и хранили полученный материал до лабораторного исследования в морозильной камере холодильника при – 18,0º С. Затем методом ИФА проводили исследование уровня перечисленных выше параметров сыворотки крови.

Все больные получали инстилляции в конъюнктивальную полость комбинированного «противоаллергического» препарата (задитен 0,04%) и препарата «искусственной слезы» (видисик гель) по 1 капле 2 раза в день, в течение 4 недель. Пациенты контрольной группы лечения не получали. Через месяц после проведенной терапии больные были обследованы повторно в том же объеме.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В таблице 1 представлены величины основных показателей слезопродукции и стабильности слезной пленки в обследуемых группах до и после лечения. Установлено, что у больных с ССГ, ассоциированным с хроническим аллергическим конъюнктивитом, и артифициальным ССГ происходит снижение времени разрыва слезной пленки до 7,7±1,2 и 9,4±1,3с., соответственно (различия по сравнению с контрольной группой статистически значимы: p<0,05). После проведенного лечения время разрыва слезной пленки у них возросло до 9,6±1,1 и 13,7±1,4с. соответственно и уже достоверно не отличалось о такового в контрольной группе (p >0,05).

Результаты пробы Ширмера I и II у пациентов с ССГ, ассоциированным с хроническим аллергическим конъюнктивитом (основная группа) были также существенно снижены и составили, соответственно, 5,7±1,2 и 3,1±2,0мм (различия по сравнению с контрольной группой статистически значимы: p<0,05). У пациентов с артифициальным ССГ (группа сравнения II) рассматриваемые показатели слезопродукции снижались менее заметно (до 12,1±2,0 и 8,2±2,3мм, соответственно: p >0,05).

Таблица 1

Величины основных показателей слезопродукции и стабильности слезной пленки в обследуемых группах до и после лечения.

Анализируемые показатели	Группы наблюдения
ССГ в сочетании с хроническим аллергическим конъюнктивитом	Хронический аллергический конъюнктивит	Артефициальный ССГ	Контрольная группа
Время разрыва СП, с. (до лечения)	7,7±1,2	17,5±2,8	9,4±1,3	19,7±2,1
Время разрыва СП, с. (после лечения)	9,6±1,1	18,4±2,7	13,7±1,4	-
Количество слезопродукции, мм/5минут.
Основной (до лечения)	3,1±2,0	11,5±1,9	8,2±2,3	10,1±2,7
Основной (после лечения)	6,1±2,1	10,5±1,8	8,5±2,4	-
Рефлекторной (до лечения)	2,6±1,3	7,4±2,7	3,9±3,1	9,8±2,8
Рефлекторной (после лечения)	6,6±1,4	8,6±2,7	5,6±3,2	-
Общей (до лечения)	5,7±1,2	18,8±3,1	12,1±2,0	19,9±2,0
Общей (после лечения)	12,7*±1,7	19,4±3,8	14,1±2,4	-
Высота слезного мениска, мм.
До лечения	1,1±0,2	3,0±0,3	1,2±0,7	3,1±0,4
После лечения	2,1±0,6	3,2±0,3	2,5±0,4	-

* Различия по сравнению с показателями до лечения статистически значимы (р <0,05).