Иммунофармакологическая активность ладастена в экспериментальной модели тревожной депрессии у мышей (стр. 2 )

3. Развитие экспериментальной тревожной депрессии у самцов мышей сопровождается нарушением весовых индексов и субпопуляционного состава Т-лимфоцитов тимуса и селезёнки, динамическими изменениями содержания провоспалительных цитокинов IL-4, IL-6 и IL17 в зависимости от стадии развития тревожно-депрессивного состояния.

4. Ладастен (30 мг/кг, в/б) в экспериментальной модели тревожной депрессии значимо снижает уменьшение массы тимуса и увеличение массы селезёнки экспериментальных животных, предупреждает нарушение субпопуляционного состава Т-лимфоцитов органов и снижает и/или восстанавливает содержание провоспалительных цитокинов до уровня контрольных значений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные

Исследование проводили на самцах мышей линии СВА, на самцах и самках мышей линий C57BL/6 массой 18-20 г, беспородных самцах белых крыс массой 160-180 г, полученных из сертифицированных питомников РАМН, содержавшихся в условиях вивария ФГБУ «НИИ фармакологии им. » РАМН при естественном освещении и свободном доступе к воде и брикетированному сбалансированному комбикорму. В работе использовано 320 мышей, 50 крыс.

Исследуемые препараты

Ладастен (N-(2-адамантил)-N-(п-бромфенил)-амин – антиастенический препарат (Рег. № ЛСР-010257/08 от 01.01.2001), афобазол (2-[2-(морфолино)-этилтио]-5-этокси бензимидазола дигидрохлорид) – оригинальный селективный анксиолитик (Рег. № ЛС-000861 от 01.01.2001), препараты разработаны и внедрены в медицинскую практику ФГБУ «НИИ фармакологии им. » РАМН.

Выбор доз, режимов и путей введения препаратов основывался на данных, полученных при изучении специфической фармакологической активности соединений в ФГБУ «НИИ фармакологии имени » РАМН ( 1999, 2001; , 2004; 2004; , 2004; , 2005), а также требованиях соответствующих Методических указаниях МЗСР РФ. Препараты применялись в следующих дозах: афобазол 1, 5, 10 мг/кг, ладастен 10, 30, 50 мг/кг. Препараты инъецировали внутрибрюшинно (в/б) однократно и 5 дней. Ладастена вводили в 1 % растворе крахмала, раствор афобазола готовили на дистиллированной воде.

Иммунофармакологические методы

Исследования противовоспалительной активности. При исследовании противовоспалительного действия с использованием общепринятой модели острого экссудативного воспаления (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ). Ладастен и афобазол вводили в/б, в течение 5-ти дней, до иньецирования в подушечку стопы каррагенана или конканавалина А (КонА). При каррагенан-индуцированном отеке в течение 4 часов после введения индуктора ежечасно измеряли отек стопы крыс микрометром (0,1 мм). При КонА-индуцированном воспалении определяли массу лап мышей СВА через 1 час после

введения индуктора и подсчитывали индекс реакции воспаления.

Определение провоcпалительных цитокинов. Исследования влияния препаратов на содержание провоспалительных цитокинов в сыворотке крови мышей проводили в модели нейроиммунной стимуляции бактериальным липополисахаридом (LPS) (O'Connor, J.C, 2009). LPS вводили в/б в дозе 100 мкг/кг мышам линии C57BL/6 обоих полов. Ладастен и афобазол иньецировали в/б 5-ти кратно до введения эндотоксина. На 5 день опыта, через 1 час после инъекции препаратов, вводили в/б LPS, через 2 часа осуществляли забор крови путём декапитации животных. Определение концентрации цитокинов проводили методом мультиплексного исследования содержания в сыворотке крови на проточном лазерном цитометре EPICS XL4 color (Beckman Coulter, США).

Модель экспериментальной тревожной депрессии

Моделирование патологии поведения у самцов мышей линии C57BL/6 проводили по методу хронического зоосоциального стресса (Golden S.A. et. al., 2011; Brown R.W. et. al., 2011; , 2008; , 1991). Самцов помещали в экспериментальные клетки, разделенные пополам прозрачной перегородкой с отверстиями, по одной мыши на отсек. Каждый день в течение 10 мин проводили межсамцовые конфронтации (драки). В ходе 3-х, 15-ти, 20-ти и 30-ти дней стрессирования были получены особи, ежедневно терпящие поражения – «жертвы», которые были подразделены на группы, обозначенные Т3, Т15, Т20 и Т30.

Моделирование патологии поведения у самок мышей линии C57BL/6 проводили по методу психоэмоционального воздействия (ПЭВ) - содержание в «агрессивной среде» (, 2008; , 2004; , 1991). Самок в течение 30-ти дней помещали в клетки, где за перегородкой постоянно находился агрессивный самец. Ежедневно в присутствии самки проводили 10-минутные межсамцовые конфронтации при подсадке к агрессору другого самца - жертвы. Самки, испытывающие ПЭВ, оставались на своей территории в течение всего эксперимента.

Режим введения препарата стресссируемым животным. Начиная с 10 (Т15), 15 (Т20) и 25 (Т30) дня стрессирования, животных делили на две группы и в течение последующих 5-ти дней ежедневно после предоставления стресса, одной группе вводили в/б физиологический раствор, другой препарат. Через сутки после последней инъекции проводили оценку поведения животных, затем забой и измерение массы тимуса, селезёнки, анализ субпопуляционного состава Т-лимфоцитов и содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови.

Тесты оценки поведения животных

Оценку спонтанной двигательной активности проводили в течение 3 минут на инфракрасном актиметре PanLab (Испания).

Тревожное поведение оценивали по методике «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ, OpenScience, Россия). У каждого животного в течение 300 сек регистрировали число заходов и время, проведённое в открытых и закрытых рукавах лабиринта. Увеличение времени нахождения в тёмных отсеках лабиринта по сравнению с контролем расценивали как проявление тревожного поведения.

Оценку выраженности депрессивного состояния проводили с помощью видеоустановки «принудительное плавание» (ПП) (НПК, Открытая наука, Россия). С помощью программного обеспечения RealTimer в режиме работы с видеозаписью за 5 минут теста оценивали время пассивного плавания (дрейф и полная неподвижность) в воде, а также латентное время до проявления первой иммобильности. Увеличение длительности пассивного плавания мышей и уменьшение латентного времени расценивали как свидетельство выраженного депрессивно-подобного состояния.

Методы оценки иммунологических параметров

Для определения массы органов иммунной системы у мышей контрольной и опытных групп животных извлекали тимус и селезенку. Органы взвешивали, результаты выражали в относительных значениях массы органа в мг на 10 г массы мыши. Мультиплексное исследование содержания цитокинов (TNF-α, IL-6, IL-10, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-17, IFN-γ, GM-CSF) в сыворотке крови мышей проводили на проточном цитометре EPICS XL 4colors, с помощью панели FlowCytomix mouse Th1/Th2 10 plex, согласно протоколу фирмы производителя BenderMedSystem.

Исследование субпопуляционного состава Т-лимфоцитов крови, селезёнки и тимуса мышей проводили на проточном лазерном цитометре EPICS XL 4 color (Beckman Coulter, США) методом трехцветного окрашивания моноклональными антителами (Labetter J.A. et. al., 1979). К клеточной суспензии спленоцитов (тимоцитов) или цельной крови добавляли расчётное количество антител, меченных флуорохромами, к молекулам CD3-FITC/CD4-PE/CD8-PeCy5 (eBioScience, Австрия). В каждой пробе анализировали не менее 10 000 событий. Результаты обрабатывали в программе

WinMDI 2.7 и выражали в процентах клеток, манифестирующих данный маркер.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента, непараметрического критерия Манна-Уитни, Вилкоксона, и дисперсионного непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Данные представлены как MEAN ± SEM (среднее ± стандартная ошибка среднего).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одной из ведущих теорий развития и драматизации событий при депрессии является макрофагальная (цитокиновая) теория (Smith R.S., 1991; Dantzer R., 2007; Ekmekcioglu C., 2012). На этой основе была сформулирована идея об иммунофармакологической терапии депрессии с помощью препаратов, предупреждающих увеличение содержания цитокиновых маркеров воспаления (Dean B., 2011; Maes M., 2011; , 2008). В свою очередь, настоящее исследование посвящено поиску психотропных соединений с противовоспалительной активностью и оценке их эффектов в экспериментальной модели тревожной депрессии.

1. Оценка противовоспалительных свойств ладастена и афобазола

Для изучения противовоспалительного действия ладастена и афобазола были использованы модели острого экссудативного отека стопы на Кон А у мышей, разработанная в НИЛ лекарственной токсикологии ФГБУ «НИИ фармакологии имени » РАМН, и на каррагенан у крыс, которые рекомендованы нормативными документами МЗСР РФ в качестве базовых экспериментальных моделей.

1.1. Модель острого экссудативного КонА-индуцированного воспаления у мышей

Результаты экспериментов по изучению противовоспалительного действия ладастена и афобазола с использованием модели КонА-индуцированного воспаления у самцов мышей СВА представлены на рис.1.

Рис. 1. Противовоспалительное действие ладастена и афобазола в модели острого экссудативного воспаления на Кон А у мышей; n=10; * - р<0,05; ** - р<0,01 по сравнению с контролем, сравнение по t-критерию Стьюдента

Однократное в/б введение ладастена в дозах 10 мг/кг, 30 мг/кг и 50 мг/кг вызвало значимое уменьшение Кон-А индуцированной реакции воспаления на 69,7 %, 62,9 % и 63,3 %, соответственно. Афобазол, при в/б введении в дозах 1, 5 и 10 мг/кг, достоверно снижал воспалительную реакцию на 74,1 %, 76,8 % и 56,3 %, соответственно.

Таким образом, препараты в использованных диапазонах доз проявляли сходную выраженность противовоспалительного действия. Полученные результаты значимо не отличались от данных, характеризующих противовоспалительное действие препарата сравнения диклофенака.

1.2. Влияния ладастена и афобазола на поведение и содержание провоспалительных цитокинов у мышей при нейроиммунной стимуляции

На модели нейроиммунной стимуляции, вызванной введением LPS, оценили действие препаратов на поведение и уровень цитокиновых медиаторов воспаления у животных (табл. 1, рис. 2)1.

Установлено, что через 2 часа после инъекции эндотоксина происходит значительное увеличение содержания провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-6 в сыворотке крови животных в 3,8 и 332,1 раза у самцов, в 101,6 и 12,6 раза у самок, соответственно (рис. 2)1.

Рис.2 Влияние введения LPS на уровень цитокинов в сыворотке крови мышей линии C57Bl/6 и его коррекция препаратами ладастен (в/б, 10,30, 50 мг/кг) и афобазол (в/б, 1,5,10 мг/кг); * р < 0,05 по сравнению с контролем, ## р < 0,01 по сравнению с группой LPS, # р < 0,05 по сравнению с группой LPS, n=10, сравнение по непараметрическому критерию Краскела-Уоллиса (ANOVA)

__________________________________________________

1В данном и последующих опытах введение афобазола (в/б, 1, 5 и 10 мг/кг) не оказывало статистически значимого действия на изучаемые параметры. Полные данные по изучению эффектов афобазола приведены в диссертационной работе.

Введение ладастена в дозе 10 мг/кг предупреждало увеличение содержания провоспалительных цитокинов: TNFα на 46 % у самок и IL-6 на 39 % у самцов (рис. 2)1. Введение ладастена в дозах 30 и 50 мг/кг, предшествующее инъекции LPS, вызывало значимое уменьшение уровней провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-α в 1,6 и 3,2 раз у самцов, и в 2,0 и 21,3 раза у самок, соответственно.

Одновременно, на фоне введения LPS у животных выявлено снижение спонтанной двигательной активности в 1,8 -1,4 раза, пройденного расстояния в 1,5 раза, увеличение времени неподвижности в 1,3 раза, уменьшение количества «быстрых» движений в 1,8 раза в составе поведения и числа поднятия на задние лапы в 1,5 раза, в совокупности трактуемое в литературе (O’Connor J.C., 2009; Kelley K.W., 2003, Dantzer R., 2007), как депрессивно-подобное поведение (табл. 1)1.