Выявленные отличия в экспрессии иРНК TLR4 мононуклеарными клетками, активация которого важна для формирования полноценного адаптивного иммунитета, могут быть одной из причин формирования различного по продолжительности поствакцинального иммунитета при чуме и туляремии.
На основании полученных новых данных об однотипности митоген - и антигениндуцированной продукции IFN-g как в смешанной популяции лимфоцитов, так и в культуре клеток крови у вакцинированных против чумы людей, предложено использование параметров индуцированной Т-клеточным митогеном конканавалином А (лигандом TLR2) продукции маркерного цитокина IFN-g в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.
Практическая значимость. Результаты исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Определение экспрессии генов Толл-подобных рецепторов 2 и 4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей и экспериментальных животных», которые одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №7 от 01.01.2001г), утверждены директором института и применяются в практической деятельности отдела иммунологии, лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ «Микроб». Материалы исследования используются при чтении лекций на курсах первичной специализации по специальностям «Бактериология» и «Эпидемиология» с основами безопасной работы с патогенными биологическими агентами I – II групп при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Основные положения, выносимые на защиту
1. Рекомбинантный штамм Y. pestis КМ 277 – продуцент капсульного антигена чумного микроба Ф1, выделенный из него капсульный антиген Ф1, а также химическая чумная вакцина индуцируют повышение экспрессии иРНК TLR2 в первые часы после введения в организм экспериментальных животных с последующим усилением пролиферативной активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета.
2. Протективный антигенный комплекс, полученный из вакцинного штамма голарктического подвида F. tularensis 15 НИИЭГ, вызывает повышение экспрессии клетками адаптивного (спленоцитами) иммунитета как TLR2, так и TLR4, в отличие от препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из вирулентного штамма F. tularensis 503/840 голарктического подвида и штамма F. tularensis А179 среднеазиатского подвида, которые индуцируют повышение экспрессии только TLR2. Препарат протективного антигенного комплекса, полученный из штамма F. tularensis В399 A'Cole неарктического подвида, не вызывает изменений экспрессии исследуемых типов Toll-подобных рецепторов.
3. Препараты капсульного антигена, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, препараты протективного антигенного комплекса туляремийного микроба различных подвидов защищают экспериментальных животных (аутбредных мышей) от гибели в условиях моделирования чумной и туляремийной инфекции, в дозе 100 мкг не оказывают токсического действия и не вызывают по данным проточно-цитофлуориметрического мониторинга повреждения иммунокомпетентных клеток по типу апоптоза.
Протективная активность капсульного антигена, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, в 3 раза выше по сравнению с препаратами капсульного антигена, выделенного из вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ.
4. Вакцинация людей против чумы и туляремии живыми вакцинами вызывает различные изменения уровня экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 в лейкоцитах периферической крови. Введение живой чумной вакцины в противоположность живой туляремийной вакцине приводит к исчезновению в мононуклеарных клетках привитых детектируемого уровня экспрессии иРНК TLR4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК TLR2. Сочетанная вакцинация против чумы и туляремии индуцирует экспрессию иРНК TLR2 и TLR4.
5. Сравнительная оценка спонтанной, митоген - и антиген-индуцированной продукции IFN-g и IL-4 в культуре клеток крови людей, вакцинированных живой чумной вакциной, живой туляремийной вакциной указывает на преимущественное развитие Th1-зависимого иммунного ответа. Параметры индуцированной лигандом TLR2 Т-клеточным митогеном конканавалином А продукции маркерного цитокина IFN-g предложены в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и представлены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств – участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств – участников содружества независимых государств» (Волгоград, 2008); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010); научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2009–2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них статей в рекомендованных ВАК изданиях – 4.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 85 отечественных и 195 зарубежных источников. Объем диссертации составляет 177 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 18 таблицами.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы
В работе использовали: 1) Штаммы микроорганизмов – рекомбинантный штамм Y. pestis КМ 277 (ЕV11МpFSK3) Kmr –продуцент капсульного антигена; вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ (Pgm-, pFra+, pCad+, pPst+); вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ; вирулентный штамм Y. pestis 231 (pPgm+, pFra+, pCad+, pPst+); вирулентный штамм F. tularensis 503/840. Все указанные штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». 2) Антигены – убитые нагреванием клетки вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ; коммерческий препарат «Тулярин» производства ГУП НПО «Микроген» (Россия), представляющий собой взвесь убитых нагреванием клеток вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ; Т-клеточный митоген конканавалин А (Con A; “Sigma”, США); капсульный антиген (ФI), выделенный из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277 и вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ; экспериментальная химическая чумная вакцина (серия 2), состоящая из ФI чумного микроба и основного соматического антигена (ОСА) возбудителя псевдотуберкулеза; протективные антигенные комплексы туляремийного микроба, полученные из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ subsp. holarctica, вирулентных штаммов F. tularensis 503/840 subsp. holarctica, F. tularensis B399 A′Cole subsp. nearctica, F. tularensis A-179 subsp. mediasiatica.
Препараты капсульного антигена, выделенного из вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ любезно предоставлены доктором биологических наук, профессором (лаборатория биохимии и протеомики РосНИПЧИ «Микроб»). Все препараты протективного антигенного комплекса туляремийного микроба, капсульный антиген (ФI), выделенный из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, получены из лаборатории экспериментальной биотехнологии РосНИПЧИ «Микроб».
Экспериментальная часть выполнена с использованием в качестве биомоделей 600 аутбредных и 250 инбредных мышей линии BALB/c массой (18±2) г, полученных из отдела экспериментальных животных с виварием РосНИПЧИ «Микроб».
В ходе выполнения работы были обследованы 38 вакцинированных волонтеров и 8 не привитых доноров в качестве группы сравнения. Вакцинацию отечественными коммерческими живой чумной вакциной производства ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора и живой туляремийной вакциной производства ГУП НПО «Микроген» проводили накожным способом в плановом порядке согласно приказу Минздрава России
«О национальном календаре профилактических прививок и календаре прививок по эпидемическим показаниям» и в строгом соответствии с утвержденными инструкциями по применению вакцин. Клинические лабораторные исследования проводились согласно лицензии на медицинскую деятельность №ФС91 от 01.01.2001г, выданной Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на осуществление медицинской деятельности РосНИПЧИ «Микроб».
Микробиологические и биологические методы. Для культивирования чумного микроба использовали агар Хоттингера рН 7,2±0,1, для культивирования туляремийного микроба – FT-агар с глюкозо-витаминной добавкой (ГНЦ ПМБ, г. Оболенск). Штаммы Y. pestis EV НИИЭГ, Y. pestis КМ 277 и Y. pestis 231 выращивали при температуре 28ºC в течение 48 ч. Штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ, F. tularensis 503/840 – при 37ºC в течение 48 ч.
Для последующей работы (приготовление иммунизирующих и заражающих доз, убитых клеток) с плотных питательных сред визуально и под малым увеличением микроскопа отбирали колонии чумного и туляремийного микробов, типичные по своим культурально-морфологическим свойствам. Одновременно контролировали бактериоскопически морфологические и тинкториальные свойства клеток в мазках, окрашенных по Граму.
Убитые клетки Y. pestis EV НИИЭГ использовали в качестве индуктора экспрессии изучаемых Toll-подобных рецепторов и продукции цитокинов. Для их получения из двухсуточной культуры чумного микроба готовили взвесь клеток в стерильном физиологическом растворе по стандартному образцу мутности ОСО П 10 единиц, эквивалентному 1 х 109 м. к. в 1 мл. Полученную взвесь прогревали при 60ºC в течение 1 ч 20 мин [, 1964].
Необходимые концентрации культур чумного и туляремийного микробов для иммунизации экспериментальных биомоделей и определения напряженности иммунитета в тесте активной защиты мышей готовили методом серийных разведений в соответствии с МУ 3.3.1.1113-02 «Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба» и МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба».
Для определения напряженности противочумного иммунитета при иммунизации вакцинным штаммом чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ проводили расчет LD50 заражающего вирулентного штамма Y. рestis 231. Для оценки протективных свойств антигенных препаратов чумного и туляремийного микробов применяли метод определения ImD50 при заражении высоковирулентными штаммами Y. рestis 231 и F. tularensis 503/840 дозами 400 LD50 и 100 LD50 соответственно. Гибель от чумной или туляремийной инфекции подтверждалась наличием соответствующей патологоанатомической картины и результатами высевов из органов павших животных на питательные среды. Величину LD50 или ImD50 расcчитывали по методу Кербера в модификации (1962).
Молекулярно-биологические методы (определение экспрессии генов TLR2, TLR4 и генов цитокинов IFN-γ, IL-4). Для определения экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 применяли полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Выделение нуклеиновых кислот проводили методом аффинной сорбции на частицах силикагеля с помощью комплекта «РИБО-сорб» (ИЛС, РФ) в соответствии с инструкцией производителя. Для получения препарата чистой РНК без примеси ДНК полученную смесь РНК/ДНК обрабатывали ДНКазой, свободной от РНКаз «DNase I, RNase-free» («Fermentas», Литва) в соответствии с приложенным протоколом. Обратную транскрипцию осуществляли с использованием комплекта «РЕВЕРТА» (ИЛС, РФ). Для проведения ПЦР применяли специфические праймеры (таблица 1, 2).
Таблица 1 – Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе для определения экспрессии TLR2 и TLR4 у людей
Экспрессия генов | Названия праймеров | Последовательность (5′ - 3′) |
GAPDH | GAPDH-f GAPDH-r | GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT TGG GAT TTC CAT TGA TGA CA |
TLR2 | TLR2h-f TLR2h-r | GCC AAA GTC TTG ATT GAT TGG TTG AAG TTC TCC AGC TCC TG |
TLR4 | TLR4h-f TLR4h-r | TGG ATA CGT TTC CTT ATA AG GAA ATG GAG GCA CCC CTT C |
Таблица 2 – Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе для определения экспрессии TLR2, TLR4, IFN-γ, IL-4 у биомодельных мышей
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
