Влияние бактерий Yersinia pestis, Francisella Tularensis и их антигенов на экспрессию ТOLL-подобных рецепторов (TLR2, TLR4) клетками врожденного и адаптивного иммунитета (стр. 4 )

Выявленные отличия могут быть связаны со структурно-функциональными особенностями синтезируемого при разных температурных условиях липополисахарида (ЛПС) чумного микроба – основного лиганда TLR4. Возбудитель чумы при температуре 37˚С синтезирует тетра-ацилированный липид А (эндотоксический компонент ЛПС) с очень слабо стимулирующей TLR4 активностью и одновременно обладающий свойствами антагониста для гекса-ацилированной структуры ЛПС с более выраженным стимулирующим действием, синтезируемым при температуре 28˚С. Данный феномен связывают с потерей Y. pestis LpxL, одной из «последних» ацилтрансфераз в цепочке биосинтеза липида А [Montminy S.W. et al., 2006; Airhart C.L. et al., 2008], со способностью тетра-ацилированного ЛПС снижать экспрессию костимулирующих молекул CD40, CD86, молекул главного комплекса гистосовместимости II класса на поверхности моноцитов и дендритных клеток человека [Telepnev M.V. et al., 2009], ингибировать сигнальные пути активации транскрипционного фактора NF-κB [Gelman A.C. et al., 2004], а также регулируемую через TLR4 продукцию IL-12(p40)2, необходимого для реагирования дендритных клеток на индуцированные чумным микробом хемокины, их последующей миграции и имеющего важное значение в инициации формирования антибактериального адаптивного иммунитета [Cooper A.M., Khader S., 2007; Robinson R.T. et al., 2008].

М – Маркер молекулярных масс по 100 п. н.; 1 – TLR2; 2 – TLR4; 3 – GAPDH.

Рисунок 3 – Экспрессия Toll-подобных рецепторов и GAPDH гранулоцитами крови у волонтера до и спустя 3 мес после сочетанной вакцинации ЖЧВ и ЖТВ

ЛПС туляремийного микроба в основном так же имеет тетра-ацилированную структуру, обладает очень слабой стимулирующей активностью и не взаимодействует с TLR4 [Gunn J.S., Ernst R.K., 2007]. В то же время, синтезируемый F. tularensis белок теплового шока DnaK способен активно связываться с TLR4 и инициировать высокий уровень продукции цитокинов дендритными клетками [Ashtekar A.R. et al., 2008], что, по-видимому, и обуславливает зарегистрированную выраженную экспрессию иРНК TLR4 в мононуклеарных клетках у всех обследованных как после вакцинации живой туляремийной вакциной, так и после сочетанной вакцинации против чумы и туляремии.

Выявленные различия в экспрессии TLR4 мононуклеарными клетками крови вакцинированных против чумы и туляремии могут быть одной из причин формирования различного по продолжительности поствакцинального иммунитета при чуме и туляремии.

Следующим этапом наших исследований было проведение сравнительной оценки спонтанной, митоген - и антигениндуцированной продукции IFN-g, IL-4 в культуре клеток крови людей, вакцинированных живой чумной вакциной, живой туляремийной вакциной и возможности использования данного показателя для оценки функциональной активности Th1 и Th2 клеток в зависимости от напряженности противочумного и противотуляремийного иммунитета. В качестве неспецифического индуктора использовали стандартный коммерческий Т-клеточный митоген конканавалин А, являющийся лигандом TLR2 [Sodhi A. et al., 2007]. В качестве специфических индукторов применяли убитые нагреванием клетки вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ и коммерческий препарат «Тулярин», представляющий собой взвесь убитых нагреванием клеток вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ.

Известно, что у привитых против чумы лиц напряженный иммунитет наиболее выражен в первые месяцы после введения живой чумной вакцины [ и др., 1973]. Установлено, что в этот период митоген-индуцированная продукция IFN-g в группе вакцинированных в 5 раз превышала уровень спонтанной продукции данного цитокина, что свидетельствует о высокой функциональной активности Т-хелперов 1 типа. По истечению года после вакцинации интенсивность синтеза IFN-g в культуре клеток крови под действием митогена значительно снижалась.

При культивировании клеток крови вакцинированных против чумы людей с Т-клеточным митогеном Con A отмечалось статистически достоверное повышение продукции IL-4 через 3 месяца после прививки, которое уже не определялось через год с момента вакцинации. Полученные данные свидетельствуют о повышении функциональной активности также и Т-хелперов 2 типа и участии Th2-клеток в формировании противочумного иммунитета у людей при вакцинации живой чумной вакциной, что согласуется с результатами экспериментальных исследований S.J. Elvin и E.D. Williamson [2004] в условиях аэрозольного заражения Y. pestis мышей Stat4-/-, Stat6-/- и заключением авторов о возможном смешанном типе Т-клеточного иммунного ответа при чуме со значительным превалированием Th1-зависимого ответа.

Для подтверждения связи выявленных изменений цитокинового профиля у лиц, вакцинированных против чумы, с повышением функциональной активности цитокинсекретирующих мононуклеарных клеток в ответ на введение живой чумной вакцины через 3 месяца после вакцинации был проведен сравнительный анализ уровня митоген - и антигениндуцированной продукции IFN-g, IL-4 в смешанной популяции лимфоцитов крови, выделенных в градиенте плотности, при культивировании со специфическим (убитые клетки Y. pestis EV НИИЭГ) и неспецифическим (Con A) индукторами (таблица 3).

В отличие от не привитых доноров, у вакцинированных живой чумной вакциной лиц зарегистрировано достоверное повышение функциональной активности цитокинсекретирующих клеток, в первую очередь Th1-клеток. Сравнительный анализ продукции IFN-g (маркера Th1-клеток) в ответ на митогенную и антигенную стимуляцию выявил однотипность как по вектору, так и по амплитуде в реализации цитокинсекретирующей функции Т-хелперами 1-го типа. Статистически достоверное повышение продукции IL-4 (маркера Th2-клеток) в смешанной популяции лимфоцитов отмечалось только при активации клеток Т-клеточным митогеном Con A. При антигенной стимуляции также наблюдалась тенденция к повышению продукции IL-4, однако значения не были статистически достоверными.

Таблица 3 – Митоген - и антигениндуцированная продукция IFN-g, IL-4 мононуклеарными клетками крови людей, через 3 месяца после вакцинации коммерческой живой чумной вакциной

Показатель	Время инкуба-ции лимфо-цитов без / с индук-торами	Не вакцинированные (группа сравнения)	Вакцинированные
Лимфоциты	Лимфоциты
Без индук-тора	Con А	Y. pestis EV НИИЭГ	Без индук-тора	Con А	Y. pestis EV НИИЭГ
M ± m	M ± m	M ± m	M ± m	M ± m	M ± m
IFN-g пг/мл	2 ч	13,3 ± 0,9	15,6 ± 0,4	22,9± 8,9	12,2 ± 1,7	16,9±3,7	35,7± 4,7*
24 ч	11,5 ± 0,4	17,6 ± 3,4	15,3 ± 1,4	15,3 ± 1,4	22,9±2,2*	23,5±5,0
IL-4 пг/мл	2 ч	0,53 ± 0,3	0,6 ± 0,5	0,63 ± 0,4	0,3 ± 0,1	0,83±0,15*	0,5 ± 0,2
24 ч	0,26 ± 0,2	0,43 ± 0,3	0,55 ± 0,3	0,11± 0,05	0,5 ± 0,46	0,37± 0,31
Примечания: n – везде 8; * - р < 0,05 при сравнении с уровнем спонтанной (без индуктора) продукции цитокина

Таким образом, результаты исследования однозначно указывают на преимущественное развитие Th1-зависимого иммунного ответа организма людей на введение живой чумной вакцины, что подтверждается также отсутствием у обследованных лиц положительной сероконверсии (в соответствии с международными стандартами это 4-х кратное повышение титров антител) при определении в системе реакций РНГА и РТНГА антител к капсульному антигену Ф1 чумного микроба.

Полученные данные об однотипности митоген - и антигенинду-цированной продукции IFN-g как в смешанной популяции лимфоцитов, так и в культуре клеток крови у вакцинированных против чумы людей, дают основание считать возможным использование параметров митоген-индуцированной продукции маркерного цитокина IFN-g в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Выводы

1. Установлено, что препараты капсульного антигена, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективного антигенного комплекса туляремийного микроба различных подвидов защищают экспериментальных животных (аутбредных мышей) от гибели в условиях моделирования чумной и туляремийной инфекции, в дозе 100 мкг не оказывают токсического действия и не вызывают по данным проточно-цитофлуориметрического мониторинга повреждения иммунокомпетентных клеток по типу апоптоза. Капсульный антиген, полученный из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, по своей протективной активности значительно эффективнее (в 3 раза) препаратов капсульного антигена, выделенных из вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ.

2. Выявленные особенности экспрессии иРНК TLR2, TLR4 в клетках врожденного (перитонеальные макрофаги) и адаптивного (спленоциты) иммунитета биомоделей в ответ на введение штаммов Y. pestis с различной генетической характеристикой, вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ голарктического подвида, а также антигенов чумного и туляремийного микробов (капсульный антиген из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективный антигенный комплекс туляремийного микроба различных подвидов), по уровню и кинетике зависят от вводимого антигена и вида возбудителя, из которого он был выделен.

3. Рекомбинантный штамм Y. pestis КМ 277, полученный из него препарат капсульного антигена Ф1, а также химическая чумная вакцина, в отличие от вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и выделенных из него препаратов Ф1, индуцируют повышение экспрессии иРНК TLR2 и IFN-g уже в первые часы после введения в организм экспериментальных животных с последующим усилением пролиферативной активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета.

4. В ответ на введение экспериментальным биомоделям препарата протективного антигенного комплекса (ПАК) из вакцинного штамма голарктического подвида F. tularensis 15 НИИЭГ, зарегистрировано повышение экспрессии спленоцитами как TLR2, так и TLR4. Напротив, препараты протективных антигенных комплексов, выделенные из вирулентного штамма голарктического (F. tularensis 503/840) и среднеазиатского (F. tularensis А179) подвидов, индуцировали усиление экспрессии только TLR2 в сочетании с IFN-g. Препарат протективного антигенного комплекса, полученный из штамма

F. tularensis A'Cole неарктического подвида, не вызывал изменений экспрессии исследуемых типов Toll-подобных рецепторов.

5. Выявлены отличия уровней экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 лейкоцитами периферической крови у людей, вакцинированных живой чумной и живой туляремийной вакцинами. Если в гранулоцитах через 3 месяца после вакцинации против чумы и туляремии транскрипционная активность генов TLR2 и TLR4 не была существенно изменена, то в мононуклеарных клетках введение живой чумной вакцины в противоположность живой туляремийной вакцине приводило к исчезновению детектируемого уровня экспрессии иРНК TLR4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК TLR2. Сочетанная вакцинация против чумы и туляремии индуцировала экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 как гранулоцитами, так и мононуклеарными клетками вакцинированных доноров.

6. Результаты проведенной сравнительной оценки спонтанной, митоген - и антигениндуцированной продукции IFN-g и IL-4 в культуре клеток крови людей, вакцинированных живой чумной вакциной, живой туляремийной вакциной свидетельствуют о преимущественном развитии Th1-зависимого иммунного ответа организма людей. Выявленная однотипность митоген - и антигениндуцированной продукции IFN-g как в смешанной популяции лимфоцитов, так и в культуре клеток крови у вакцинированных против чумы людей дают основание считать возможным использование параметров индуцированной лигандом TLR2 Т-клеточным митогеном конканавалином А продукции маркерного цитокина IFN-g в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Н., *, , , Кутырев иРНК Toll-подобных рецепторов-2,4 лейкоцитами крови людей вакцинированных против чумы и туляремии//Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств – участников СНГ: Матер. IX Межгосуд. науч.-практ. конф. – Волгоград, 2008. – С. 156 – 157.

2. , *, . , , Кутырев экстренной и специфической профилактики особо опасных инфекций: новые перспективы// Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы Всеросс. науч.-практ. конф. – Москва, 2008. – С. 129.

3. , , *, Бессонова мониторинг реактивности лейкоцитов крови людей вакцинированных туляремийной вакциной, индуцированных тулярином и //Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы Всеросс. науч.-практ. конф. – Москва, 2008. – С. 109.

4. , , , Клюева -индуцированная продукция IFNγ и IL-4 в культуре цельной крови людей в различные сроки после вакцинации живой чумной вакциной// Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями: Матер. междунар. конф./ Под ред. . – СПб.: ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, 2010. – С. 42.

5. А., , Никифоров и пролиферативная активность иммунокомпетентных клеток биомоделей при иммунизации С-комплексом туляремийного микроба различных подвидов// Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения стран-участников СНГ: Матер. Х Межгосуд. науч.-практ. конфер. государств-участников СНГ. – Ставрополь, 2010. – С. 269–270.

6. , , ДНК-цитометрия иммунокомпетентных клеток биомоделей в условиях иммунизации препаратами «С»-комплекса туляремийного микроба различных подвидов// Проблемы особо опасных инфекций. – 2011. – Вып– С. 74–76.

7. , , А., , Никифоров свойства антигенных комплексов туляремийного микроба// Проблемы особо опасных инфекций. – 2011. – Вып– С. 46–49.

8. , , Смолькова проточной цитометрии при разработке вакцин против особо опасных инфекций: современные достижения и перспективы//Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2011. – Вып– С. 53 – 60.

9. , , Бугоркова продукция IFN-γ и IL-4 как показатель функциональной активности Th1- и Th2-клеток у вакцинированных против чумы людей// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2011. – Вып– С. 78 – 83.

*- фамилия автора изменена на