На правах рукописи

СМОЛЬКОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЙ YERSINIA PESTIS,

FRANCISELLA TULARENSIS И ИХ АНТИГЕНОВ НА ЭКСПРЕССИЮ Тoll-подобных рецепторов

(TLR2, TLR4) КЛЕТКАМИ ВРОЖДЕННОГО

И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА

03.02.03 – микробиология

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Саратов – 2012

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

кандидат медицинских наук,

доцент

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

, доктор медицинских наук, профессор, ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, зав. лабораторией

, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. » Минздравсоцразвития России, зав. кафедрой

Ведущая организация – Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «21» марта 2012 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.078.01 при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ( 6).

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан 18 февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Внедрение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в организм хозяина распознается системой врожденного иммунитета посредством набора генетически детерминированных, так называемых паттернраспознающих рецепторов (ПРР), которые имеют высокий аффинитет к консервативным микробным молекулярным фрагментам, характерным для широкого спектра микроорганизмов (пептидогликану, липополисахариду, липотейхоевым кислотам, липопротеинам, липопептидам, флагеллину, вирусной РНК, бактериальной ДНК, богатой CpolyG-последовательностями, белкам теплового шока, поринам, β-глюкану, маннану и др.) и получившим название патоген-ассоциированные молекулярные компоненты (PAMPs – pathogen-associated molecular patterns) [, 2005; Takeda K., Akira S., 2003; Uematsu S., Akira S., 2006].

ПРР представляют собой группу различных по строению и происхождению молекул, обладающих способностью взаимодействовать с PAMPs с целью их прямой нейтрализации или запуска каскада провоспалительных реакций, направленных в конечном счете на блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление патогена из организма [Ehlers S., Bulfone-Paus S., 2004].

Показано, что ключевую роль в распознавании бактериальных и вирусных патогенов играют Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLRs), локализующиеся на различных иммунокомпетентных клетках и обеспечивающие проведение внутриклеточного активационного сигнала. Эволюционная стабильность Toll-подобных рецепторов не уступает их микробным лигандам [ и др., 2008; Hallman M. et al., 2001].

В настоящее время идентифицировано 13 Toll-подобных рецепторов. Каждый из TLRs имеет присущий ему сигнальный путь, активация которого индуцирует созревание дендритных клеток, преобразование рекогносцировочного сигнала в растворимые медиаторы (цитокины, хемокины) и последующее взаимодействие их с цитокин/хемокиновыми рецепторами на Т - и В-лимфоидных клетках, развитие адаптивного иммунитета [ и др., 2008; Alexopoulou L. et al., 2002; Hornung V. et al., 2002; Netea M.G. et al., 2004; Tsan M.F., Gao B., 2004; Gorden K.B. et al., 2005; Herbst-Kralovetz M.M., Pyles R.B., 2006; Paul-Clark M.J et al., 2006].

Toll-подобные рецепторы экспрессированы конститутивно на моноцитах/макрофагах, нейтрофильных гранулоцитах, дендритных клетках, различных популяциях лимфоцитов, эндотелиальных клетках, клетках эпителия кишечника, респираторного и урогенитального тракта [Becker M.N. et al., 2000; Wong X. et al., 2002; Guillot L. et al., 2004; Sha Q. et al., 2004; Xu D. et al., 2004].

В условиях введения синтетических лигандов для конкретных TLRs показано их важное значение в формировании неспецифической резистентности к представителями рода Listeria, Francisella, M. tuberculosis, возбудителям лейшманиоза и малярии. Установлена ключевая роль TLR4 в развитии лептоспирозной инфекции и бруцеллеза [Campos M.C. et al., 2004; Katz J. et al., 2006; Viriyakosol S. et al., 2006].

Имеются единичные сообщения о важной роли TLR4 в патогенезе чумной инфекции и развитии резистентности к чуме [Montminy S. W. et al., 2006; Airhart C. L. et al., 2008], а также возможной роли TLR2 в опосредованной антигенами rLcrV и YopB Y. pestis ингибиции функции макрофагов [Sharma R. K. et al., 2004].

Мало изучено в условиях in vivo влияние клеток Y. pestis, F. tularensis и их антигенов на экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета экспериментальных биомоделей и людей. Отсутствуют сведения о сравнительном анализе экспрессии иРНК TLR2, TLR4 и экспрессии генов цитокинов Th1(IFN-γ) и Th2 (IL-4)–зависимого ответа у биомоделей в ответ на введение вакцинных штаммов Y. pestis, F. tularensis, антигенов чумного и туляремийного микробов. Отсутствуют также сведения о влиянии вакцинации коммерческими живыми чумной, туляремийной вакцинами на экспрессию TLR2 и TLR4 и продукцию цитокинов Th1 (IFN-γ) и Th2 (IL-4)–зависимого ответа клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей.

Цель исследования –изучить влияние чумного, туляремийного микробов и их антигенов на экспрессию иРНК TLR2, TLR4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета экспериментальных биомоделей и людей.

Основные задачи исследования

1. Оценить иммунобиологическую активность (токсичность, иммуногенность, протективность) препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективного антигенного комплекса (ПАК) туляремийного микроба различных подвидов.

2. Изучить влияние вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, химической чумной вакцины, препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из указанных штаммов, на экспрессию паттернраспознающих Toll-подобных рецепторов 2 и 4 типов клетками врожденного и адаптивного иммунитета биомоделей.

3. Провести исследование экспрессии генов цитокинов Th1 (IFN-γ) и Th2 (IL-4)–зависимого ответа у биомоделей при введении вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, химической чумной вакцины, препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из данных штаммов.

4. Исследовать индуцированную вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ экспрессию генов паттернраспознающих Toll-подобных рецепторов 2 и 4 типов, цитокинов (IFN-γ, IL-4) у экспериментальных биомоделей.

5. Сравнить уровень экспрессии иРНК TLR2 и TLR4, цитокинов (IFN-γ, IL-4) у биомоделей, индуцируемой протективным антигенным комплексом (ПАК) туляремийного микроба различных подвидов.

6. Изучить влияние вакцинации против чумы и туляремии на экспрессию иРНК TLR2, TLR4 и продукцию цитокинов клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей. Оценить возможность применения полученных результатов в качестве показателя эффективности вакцинации против чумы и туляремии.

Научная новизна. Получены новые сведения о характере влияния рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277 – продуцента капсульного антигена чумного микроба Ф1, выделенного из него препарата капсульного антигена Ф1, экспериментальной химической чумной вакцины, препаратов протективного антигенного комплекса туляремийного микроба различных подвидов на экспрессию in vivo иРНК Toll-подобных рецепторов 2 и 4 типов. Показано, что рекомбинантный штамм Y. pestis КМ 277, выделенный из него препарат капсульного антигена Ф1, химическая чумная вакцина индуцируют повышение экспрессии иРНК TLR2 уже в первые часы после введения в организм экспериментальных животных с последующим усилением пролиферативной активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета.

Установлено, что введение препарата протективного антигенного комплекса из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ голарктического подвида уже через 4 ч вызывает повышение экспрессии спленоцитами как TLR2, так и TLR4. Препараты протективного антигенного комплекса, полученные из вирулентного штамма голарктического (F. tularensis 503/840) и среднеазиатского (F. tularensis А179) подвидов, индуцируют усиление экспрессии только TLR2. Препарат протективного антигенного комплекса из штамма F. tularensis В399 A'Cole неарктического подвида, не вызывает изменений экспрессии исследуемых типов Toll-подобных рецепторов.

Впервые проведен сравнительный анализ экспрессии TLR2, TLR4 и экспрессии генов цитокинов Th1 (IFN-γ) и Th2 (IL-4)–зависимого ответа у биомоделей, индуцируемой вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ, рекомбинантным штаммом Y. pestis КМ 277, химической чумной вакциной, капсульным антигеном чумного микроба, выделенным из Y. pestis КМ 277 и Y. pestis EV НИИЭГ, вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, протективным антигенным комплексом туляремийного микроба различных подвидов. Получены новые данные, свидетельствующие о преимущественной экспрессии клетками врожденного и адаптивного иммунитета иРНК TLR2 и IFN-γ в условиях in vivo.

Впервые проведено сравнительное изучение влияния вакцинации против чумы и туляремии на экспрессию иРНК TLR2, TLR4 и продукцию цитокинов клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей, оценена возможность применения полученных данных для разработки критериев оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Установлено, что вакцинация людей против чумы и туляремии отечественными живыми вакцинами вызывает различные изменения уровня экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 в лейкоцитах периферической крови. Если в гранулоцитах через 3 месяца после вакцинации против чумы и туляремии транскрипционная активность генов TLR2 и TLR4 не была существенно изменена, то в мононуклеарных клетках введение живой чумной вакцины в противоположность живой туляремийной вакцине приводило к исчезновению детектируемого уровня экспрессии иРНК TLR4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК TLR2. Сочетанная вакцинация против чумы и туляремии индуцировала экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 как гранулоцитами, так и мононуклеарными клетками вакцинированных доноров.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4