Клинико-лабораторное обоснование иммунокорригирующей терапии больных с рецидивирующим афтозным стоматитом (стр. 1 )

На правах рукописи

Клинико-лабораторное обоснование иммунокорригирующей терапии больных с рецидивирующим афтозным стоматитом

14.01.14 – Стоматология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Москва-2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

– доктор медицинских наук, профессор, декан по работе с иностранными учащимися и заведующая кафедрой пропедевтики и физиотерапии стоматологических заболеваний ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика » Минздравсоцразвития России.

– доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры терапевтической стоматологии ГБОУ ДПО "РМАПО Минздравсоцразвития Росси"

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития России.

Защита состоится «16» мая 2012 г. в 1000 часов на заседании Диссертационного совета (Д 208.111.01) в ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздравсоцразвития России (конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздравсоцразвития России (ул. Тимура Фрунзе, д.16).

Автореферат разослан «16» апреля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

к. м.н.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Рецидивирующий афтозный стоматит (РАС) – хроническое воспалительное заболевание слизистой оболочки рта (СОР), характеризующееся возникновением афт (язв) и протекающее с периодическими обострениями и ремиссиями. Заболевание является одним из наиболее распространенных поражений СОР (, 2009; Scully C. et al., 2008; Porter S.R. et al., 2009; Barnes L., Chiosea S. I. et al., 2011).

Несмотря на проведенные экспериментальные и клинико-лабораторные исследования, этиология и патогенез РАС остаются до конца невыясненными (,1978; , 1984; , , 2005; , 2008; Boras V.V., Savage N.W., 2007; Porter S.R. et al., 2009; Riera M.G., Riera A.E., 2011). В связи с недостаточной эффективностью существующей терапии поиск новых средств и методов лечения данного заболевания остается актуальным.

Анализ научных исследований, посвященных оценке функционального состояния иммунной системы при афтозном стоматите, показывает неоднозначное понимание, а иногда и противоречия между авторами в интерпретации полученных данных (, 2009; Miamoto N. T., Nelson T., Borra R. C., 2008; Porter S. R. et al., 2009).

Ранее предполагалось, что в основе повреждения СОР при РАС лежат механизмы модуляции клеточного иммунного ответа, однако ряд исследователей склоняется к антителозависимым цитотоксическим реакциям либо активации иммунных комплексов (Jurge S. et al., 2006; Scully C., Porter S.R., 2008; Wilhelmsen N., Weber R., Miziara I., 2008).

Таким образом, изучение состояния местного и общего иммунитета, а также проведение морфологических и иммуногистохимических исследований очагов поражения СОР при РАС позволит значительно расширить представления о патогенезе, возможности диагностики, улучшить профилактику и лечение данного заболевания.

Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования:

Повышение эффективности лечения больных с рецидивирующим афтозным стоматитом с использованием иммунокорригирующей терапии на основании изучения иммунологического и иммуноморфологического статуса.

Задачи исследования:

1. Выявить распространенность рецидивирующего афтозного стоматита в структуре заболеваний слизистой оболочки рта по данным отделения «ЦНИИС и ЧЛХ» за последние 5 лет.

2. Систематизировать по формам и течению особенности клинических проявлений рецидивирующего афтозного стоматита.

3. Изучить иммунологическое состояние больных с различными формами рецидивирующего афтозного стоматита по данным фагоцитоза, популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, циркулирующих иммунных комплексов и цитокинов в периферической крови до и после лечения.

4. Провести морфологическое и иммуногистохимическое исследование биоптатов из очагов поражения на разных стадиях развития патологического процесса.

5. Разработать схемы комплексного патогенетического лечения больных с рецидивирующим афтозным стоматитом.

Научная новизна

Впервые проанализирована частота распространенности РАС в структуре заболеваний СОР по данным специализированного отделения ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздравсоцразвития России за последние 5 лет.

У больных с РАС СОР проведено изучение общих иммунологических процессов, а именно образования активных форм кислорода, поликлональной активации В-системы иммунитета, циркулирующих иммунных комплексов и цитокинов в периферической крови.

Впервые в России у больных с РАС проведено иммуногистохимическое (ИГХ) исследование из очагов поражения на разных стадиях развития патологического процесса.

На основании проведенных клинико-лабораторных исследований усовершенствована схема комплексной патогенетической терапии РАС, включающая применение иммуномодуляторов – полиоксидония и вобэнзима.

Практическая значимость

На основании выявленных механизмов патогенеза РАС осуществлен новый подход к лечению данного заболевания и разработаны схемы комплексного лечения (исходя из его форм), направленного на коррекцию выявленных нарушений.

Установлено, что проведение ИГХ исследования с использованием поликлональных антител к Ig A, Ig M и Ig G, Cd3 фрагменту комплемента, фактору некроза опухоли (ФНО-α) и Т-лимфоцитам (CD8+ и CD16+) позволяет осуществить мониторинг стадии развития патологического процесса в СОР при РАС. Показана высокая диагностическая значимость ИГХ исследования для выявления инициальных патоморфологических изменений при данном заболевании.

Разработан и внедрен в практику новый эффективный метод лечения РАС с применением иммунокорректоров «Полиоксидония» и «Вобэнзима», направленный на нормализацию имеющейся при данной патологии нарушения общего иммунитета.

Научные положения, выносимые на защиту:

1. РАС СОР характеризуется конкретными клиническими формами проявления, коррелирующие с нарушениями фагоцитоза и разных звеньев Т - и В-систем иммунитета.

2. РАС СОР характеризуется специфическими иммуноморфологическими особенностями на разных стадиях развития патологического процесса. Интенсивность воспалительного процесса прямо пропорциональна степени инфильтрации слизистой оболочки рта Ig A, Ig M, Ig G, Cd3 фрагментом комплемента и Т-лимфоцитами.

3. Разработанные схемы лечения являются патогенетически обоснованными. Эффективность лечения зависит от форм клинического течения, длительности заболевания и состояния иммунологической системы.

Личный вклад автора

Диссертантом определены основные идеи и дизайн исследования. Автор самостоятельно провела подробный анализ современной литературы, курировала пациентов в течение всего времени наблюдения. При участии автора были проведены серии ИГХ исследований биоптатов из очагов поражения на разных стадиях развития патологического процесса. Полученные результаты были статистически обработаны и представлены в виде текста, таблиц и рисунков.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены на III Международном конгрессе «Новые технологии в стоматологии» (Казань, 2010), на I научно-практической конференции молодых ученых «Инновационная наука - эффективная практика» (Москва, 2010), на II научно-практической конференции молодых ученых «Современные технологии в экспериментальной клинической стоматологии» (Москва, 2011).

Апробация диссертации проведена на совместном заседании сотрудников структурных подразделений: отделения кариесологии и эндодонтии, пародонтологии, заболеваний слизистой оболочки рта и профилактики стоматологических заболеваний, а также научно-организационного отдела ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздравсоцразвития России.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе в центральной печати – 4 работы.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 37 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 5 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Указатель литературы включает 220 источников, из них отечественных – 96 и зарубежных – 124.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Для достижения поставленной цели была проведена оценка клинико-анамнестического, иммунологического и иммуноморфологического статуса больных с РАС, а также разработаны схемы комплексного патогенетического лечения.

Под наблюдением находилось 90 больных (основная группа) с РАС в стадии обострения, обратившихся в отделение заболеваний слизистой оболочки рта. Кроме того, был проведен детальный анализ 50 архивных историй болезни больных с РАС, составивших контрольную группу.

Среди больных основной группы было%) женщины и%) мужчин в возрасте от 18 до 50 лет, большая часть больных – в возрасте от 25 до 34 лет. Фибринозная форма РАС выявлена у 49 человек, гландулярная – у 27, рубцующаяся – у 14 больных. Среди больных контрольной группы было%) женщины и%) мужчин. По клиническим формам больные контрольной группы были распределены следующим образом: фибринозная форма – 27 больных, гландулярная – 15, рубцующаяся – 8 больных.

По клинической характеристике, морфологическим проявлениям, длительности заболевания, характеру сопутствующей патологии основная и контрольная группы были сопоставимы.

При опросе пациента особое внимание уделяли жалобам, возможным причинам и частоте обострений, длительности проявлений афтозных элементов, наличию соматической патологии и ранее проведенному лечению.

Традиционный метод лечения больных с РАС контрольной группы включал в себя назначение общеукрепляющей (витамины группы В и С), антибактериальной и противовоспалительной (трихопол) терапии. Местное лечение заключалось в проведении противовоспалительной (0,12% раствор хлоргексидина), анальгезирующей (Тантум-Верде) и кератопластической (масляный раствор витамина А, каротолин) терапии. Всем больным, у которых были выявлены дисбиотические нарушения различной степени, назначались препараты для нормализации микрофлоры (ацилакт и бифилиз).

За клинической динамикой течения РАС наблюдали в течение 2 лет.

При лабораторном обследовании больных основной группы особое внимание было уделено изучению иммунологического состояния больных с различными формами РАС и ИГХ исследованию эпителия СОР с очагов поражения. В исследовании периферической крови были использованы данные обследования практически здоровых лиц, не имеющих хронических общесоматических заболеваний и поражений СОР (группа сравнения).

Оценку фагоцитарной активности лейкоцитов и макрофагов проводили методом проточной лазерной цитометрии с применением Stаphylococcus aureus, меченного флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) ("Sigma", США). Осуществляли также определение активных форм кислорода – изменение спонтанной и индуцированной хемилюминесценции с использованием усилителя – люминола.

Оценку состояния гуморального иммунитета проводили путем определения иммуноглобулинов в сыворотке крови; уровень Ig A, Ig M и Ig G определяли с помощью метода иммунотурбидиметрии, уровень Ig E – с помощью двухцентрового иммуноферментного анализа (ИФА) с моноклональными антителами (МАТ) против различных эпитопов молекулы Ig E. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) определяли на основании их повышенной способности осаждаться в присутствии различных концентраций полиэтиленгликоля (ПЭГ). Чем выше молекулярная масса комплекса, тем требуется меньшая концентрация ПЭГ, были использованы его 6% и 8% концентрации, позволяющие осадить крупные (малопатогенные), средние и мелкие (патогенные) комплексы. Методом ELISpot определяли уровень противовоспалительного (ИЛ-10) и провоспалительных (ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-α) цитокинов.

Т-лимфоциты (CD3+), Т-хелперы (CD4+), цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+), В-лимфоциты (CD19+) идентифицировали с помощью МАТ, меченных ФИТЦ. NK-клетки (CD16+) идентифицировали с помощью смеси двух МАТ, конъюгированных с ФИТЦ или фикоэритрином. Учет результатов проводили на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) по программе «Simulset» в специально составленной панели.

Морфологическое исследование эпителия СОР пациентов с РАС в биоптатах из очагов поражения было проведено в соответствии со стандартным протоколом. Для проведения ИГХ исследования на срезы наносили 50 мкл разведенной сыворотки и при помощи безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена (BioGenex, США) проводили выявление реакции антиген-антитело. В завершении срезы заключались в канадский бальзам под покровное стекло и исследовались под микроскопом.

Обработку результатов проводили на основе методов дисперсионного анализа данных, используя пакет компьютерных программ (Microsoft Excel 2010, Statsoft Statistica 6.0) . Вычисляли среднюю арифметическую величину (М), ошибку средней арифметической (m) и вероятность ошибки (p).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

По данным архивного материала отделения заболеваний слизистой оболочки рта ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» за период с 2005 по 2010 гг. с диагнозом рецидивирующий афтозный стоматит в отделении находилось на лечении 507 человек в возрасте от 18 до 52 лет, из которых 248 мужчин и 259 женщин. Было отмечено ежегодное увеличение частоты выявления РАС среди других заболеваний СОР. Так, в 2005 г. РАС встречался в 7% случаев, а в 2010 г. количество пациентов увеличилось и составляло уже 10%.

Все больные с РАС, принимающие участие в исследовании (основная и контрольная группа), были разделены по клиническим формам заболевания согласно классификации и (1978). Каждая форма РАС имела четкие клинические характеристики.

При фибринозной форме РАС отмечалось бело-желтое пятно, интенсивность окраски которого зависела от состояния окружающей слизистой. Фибринозная «бляшка» была спаяна с подлежащими тканями и не снималась при поскабливании. В окружении афты отмечался ободок гиперемии (демаркационный вал), ограничивающий ее от окружающей видимой нормальной слизистой оболочки. Болезненность наблюдалась в фазе развития элемента в связи с раздражением рецепторных анимальных нервных волокон медиаторами воспаления. На месте эпителизировавшихся афт слизистая оболочка оставалась неизмененной. Наиболее частым местом локализации элементов явилось преддверие полости рта, кончик и боковые поверхности языка, слизистая щек и губ.

Гландулярная форма РАС характеризовалась появлением одиночных и слившихся элементов поражения. Локализация определялась расположением малых слюнных желез и их дериватов (гранул Фордайса): слизистая губ и щек, твердое и мягкое нёбо, дно полости рта. Для гландулярной формы РАС были характерны дистрофические изменения в области протоков и ацинусов малых слюнных желез, что приводило к их сужению, закупорке и местной воспалительной реакции. В острой фазе процесса определялась резкая болезненность за счет раздражения рецепторных зон СОР. Глубина поражения определялась топографией всего протока. Воспаление распространялось на дольки желез и основное междольковое вещество, хотя мы наблюдали зияние лишь концевой части протока.

Рубцующаяся форма РАС отличалась от других форм упорным течением, длительным существованием язв (иногда до 1,5-3 мес). Язвы были выполнены некротическим детритом, в основании отмечался воспалительный плотный инфильтрат, по краям язвы отмечался плотный валик. Болезненность даже в начальной стадии процесса была выражена. По периферии рубцующихся язв часто появлялись мелкие эрозивные элементы идентичного характера. Их появление задерживало сроки эпителизации. Эпителизация рубцующихся язв была замедленной, что было связано с глубиной поражения, рецидивирующей активацией незаконченного воспаления по краям и вблизи первичного элемента. У больных с частыми рецидивами слизистая оболочка была бугристая с участками рубцевания. Рубцы нежные, в последующем рассасывающиеся и почти не деформирующие слизистую оболочку.

Помимо общепринятого лабораторного обследования, было проведено иммунологическое исследование.

При изучении функциональной активности фагоцитов отмечена тенденция к усилению образования активных форм кислорода. Наиболее выраженные изменения отмечались у больных с рубцующейся формой РАС (323,4±66,5) относительно группы сравнения (211,4±19,6), что является отражением значительной остроты воспалительного процесса.

Результаты изучения клеточного иммунитета показали, что при всех формах РАС наблюдалась отчетливая тенденция к повышению уровня CD8+ клеток, являющихся цитотоксическими лимфоцитами и выполняющие важную роль по элиминации из организма чужеродных клеток. При фибринозной (40,2±2,13) и гландулярной форме (41,9 ± 3,21) CD8+ Т-лимфоциты были незначительно повышены относительно группы сравнения (36,1±3,71), тогда как у больных с рубцующейся формой РАС регистрировалось значительное их увеличение (45,6±3,57).

Содержание NK-клеток в периферической крови возрастало в небольшом количестве при гландулярной (27,3±2,37) и рубцующейся форме (25,1±1,43), а при фибринозной форме (22,2±1,23) уровень CD16+ Т-клеток был сопоставим с группой сравнения (21,5±1,78).

При определении цитокинов в периферической крови больных с РАС было установлено повышенное содержание провоспалительных цитокинов (ИЛ-8, ФНО-a) среди всех форм РАС (табл. 1).

Таблица 1

Содержание интерлейкинов в периферической крови у больных с РАС (пг/мл) (n = 110)

Группа	ИЛ-8	ФНО-a
Группа сравнения	45,2 ± 23,3	3,1 ± 2,1
Фибринозная	85,13 ± 21,6*	9,8 ± 2,3*
Гландулярная	80,31 ± 16,3*	8,3 ± 2,4*
Рубцующаяся	71,2 ± 23,7	5,1 ± 2,37

*Разница статистически достоверна (p<0,05).

Несмотря на то, что наибольшее повреждение слизистой оболочки происходили при рубцующейся форме РАС, в сыворотке крови у больных данной группы было выявлено незначительное повышение провоспалительных цитокинов (табл. 1), что указывает на несостоятельность целого ряда иммунных механизмов, в частности фагоцитарной активности, так как ИЛ-8 является хемоаттрактантом для нейтрофилов.

Изучение содержания иммуноглобулинов и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови больных с РАС позволило получить следующие данные: уровень Ig A незначительно повышался среди 3 форм больных с РАС, что можно расценить как защитную реакцию на микробную инвазию. Усиление продукции Ig M и Ig G при фибринозной и гландулярной форме явилось результатом острого воспалительного процесса и наличия хронического воспаления при рубцующейся форме РАС. Повышение уровня ЦИК к Ig G также свидетельствует об активном участии данного класса иммуноглобулинов в хроническом воспалительном процессе у больных с рубцующейся формой РАС. Уровень Ig E был повышен относительно группы сравнения у пациентов с гландулярной формой РАС. Усиленная продукция Ig E при гландулярной форме позволяет говорить об аллергизации организма микробными агентами (табл. 2).

Таблица 2

Показатели гуморального иммунитета у больных с различными формами РАС (n = 110)

Группа	Ig A, г/л	Ig M, г/л	Ig G, г/л	Ig E, МЕ	ЦИК к Ig G, усл. ед.
Группа сравнения	2,50 ± 1,70	1,25 ± 0,45	14,20 ± 3,50	67,10 ± 3,24	0,09 ± 0,03
Фибринозная	2,60 ± 0,22	3,10 ± 0,32	19,10 ± 2,10	57,30 ± 1,42	0,06 ± 0,04
Гландулярная	2,62 ± 0,11	2,90 ± 0,24	21,20 ± 3,50	89,30 ± 3,14	0,10 ± 0,03
Рубцующаяся	2,59 ± 0,12	3,21 ± 0,13	24,30 ± 2,17	70,20 ± 1,74	0,17 ± 0,05

При гистологическом исследовании было выявлено, что в начале развития афтозного элемента лежат процессы лимфоцитарной инфильтрации эпителия и развитие отека. Фибринозно-некротическое воспаление слизистой оболочки начинается с изменений в подслизистой оболочке; вслед за расширением сосудов и периваскулярной инфильтрацией происходит отек шиповатого слоя эпителия, затем спонгиоз и формирование микрополостей. Начальные изменения заканчиваются некрозом эпителия и эрозированием слизистой оболочки. Дефект эпителия заполняется фибрином, который прочно спаивается с подлежащими тканями. Процесс заживления характеризуется формированием в области дна язвы грануляционной ткани и эпителизацией за счет регенерации эпителия и закрытия язвенного дефекта СОР.