Диагностика туберкулеза в современной централизованной микобактериологической лаборатории г. Москвы (стр. 3 )

В качестве контроля питательных сред для выделения МБ, выбран их оптимальный комплекс – сочетание жидкой среды М7Н9 в АС и плотной яичной Л-Й.

Чашки с агаровой средой Миддлбрука 7Н11 целесообразнее применять для субкультивирования штаммов МБ, полученных как в жидкой, так и на плотной питательных средах, вызывающих трудности при идентификации (контаминированные посторонней микрофлорой, содержащие более одного вида микобактерий, выделенные от больных, длительно получающих курс химиотерапии).

2.2. Выявление микобактерий туберкулеза в биологическом материале с помощью молекулярно-генетических методов. С целью раннего обнаружения M. tuberculosis наряду проведены молекулярно-генетические исследования клинического материала с помощью биологического микрочипа «ТБ-БИОЧИП».

Микробиологическими в комплексе с МГМ за период с января 2008 по декабрь 2009 гг. исследовано 3870 образцов мокроты, промывных вод бронхов, бронхиальных смывов, полученных от 1548 пациентов: впервые выявленных больных туберкулезом, лиц с подозрением на рецидив заболевания туберкулезом и «диагностических» (таблица 5).

Таблица 5.

Сопоставление результатов выявления МБТ в диагностическом материале больных при культивировании в BACTECТМMGITТМ 960 и с помощью «ТБ-БИОЧИП»

Количество образцов	Совпадение результатов	Расхождение результатов
ТБ-БИОЧИП+ BACTEC +	ТБ-БИОЧИП - BACTEC -	ТБ-БИОЧИП + BACTEC -	ТБ-БИОЧИП - BACTEC +
3870	842	2503	275	250
100%	86,4%	7,1%	6,5%

Сравнительный анализ применения культурального метода на жидких питательных средах и с помощью тест системы «ТБ-БИОЧИП» показал совпадение результатов определения МБТ в клиническом материале в 86,4% случаев: 842 положительных и 2503 отрицательных. В то же время из 275 проб (7,1%), давших положительный результат на наличие МБТ при исследовании с помощью «ТБ-БИОЧИПа», культуру микробиологическим методом выделить не удалось; в 250 клинических образцах (6,5%) получена культура МБТ при отрицательном результате исследования с помощью «ТБ-БИОЧИПа». Это связано, как с малым числом микробных тел в материале, так и с низкой их жизнеспособностью.

Однако, при исследовании клинического материала с помощью тест системы «ТБ-БИОЧИП» преимущественным является скорость получения результатов – не более 48 часов, а также возможность получения информации не только о наличии и виде возбудителя, но также и его ЛЧ. С помощью микробиологических методов эту информацию можно получить не ранее 21 дня даже при использовании автоматизированных систем культивирования на основе жидких питательных сред.

Таким образом, применение в алгоритме исследования МГМ в 93,5% дает возможность врачу-клиницисту в течение 48 часов получить информацию о состоянии микробной популяции пациента.

2.3. Идентификация видов выделенных культур микобактерий. Нами была изучена возможность применения в алгоритме МГМ и биохимических тестов для видовой идентификации выделенных культур МБ. Предварительную дифференциацию проводили по характеру роста методом микроскопии мазков культур на наличие кислотоустойчивых микобактерий.

Культуры, содержащие постороннюю микрофлору и более одного вида микобактерий, субкультивировали на чашках с агаровой средой М7Н11 с целью получения чистой культуры. Окончательное установление вида выделенной культуры МБ проводили с помощью тест-системы БИОЧИП «IMS», ВЭЖХ и биохимических тестов (таблица 6).

Таблица 6.

Сопоставление результатов идентификации микобактерий, полученных с помощью БИОЧИП «IMS» и ВЭЖХ, с данными

микробиологических исследований (%)

Вид микобактерий (абс)	Метод идентификации и процент совпадения
БИОЧИП-IMS	ВЭЖХ
абс.	%	абс.	%
МБТ (n=134)	132	98,5	130	97,0
Медленнорастущие НТМБ (n=246)	239	97,2	237	96,3
Быстрорастущие НТМБ (n=128)	123	96,1	124	96,9
ВСЕГО (n=508)	494	97,2	491	96,7

Результаты МГМ получены в сроки от 24 до 48 часов в отличие от результатов культуральных исследований, возможность получения которых зависит от сроков культивирования возбудинедель) и результатов биохимической идентификации (12-14 дней).

Полученные с помощью микробиологических методов данные идентификации МБ при параллельном исследовании МГМ показали высокий уровень совпадений: МБТ в 98,5% с БИОЧИП «IMS» и в 97,0% с ВЭЖХ, медленнорастущие НТМБ - в 97,2% и в 96,3%, быстрорастущие НТМБ – в 96,1% и в 96,9% соответственно (p>0,05).

Таким образом, результаты проведенных исследований с целью раннего выявления бактериовыделителей подтверждают необходимость одновременного использования автоматизированных систем, плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена и биологических микрочипов «ТБ-БИОЧИП» для исследования биологического материала, полученного от впервые выявленных больных и лиц с подозрением на это заболевание или его рецидив.

Для получения полной информации о виде выделенного возбудителя на первом этапе идентификацию целесообразно проводить с помощью биологических микрочипов «IMS» и/или ВЭЖХ с последующим подтверждением полученных данных микробиологическими методами.

3. Изучение лекарственной чувствительности микобактерий

Использование автоматизированной системы для определения лекарственной чувствительности микобактерий к ПТП основного ряда является одной из важных составляющих в работе централизованной микобактериологической лаборатории. Данные о ЛЧ, полученные в максимально короткие сроки, дают возможность назначения адекватной противотуберкулезной терапии и своевременной корректировки ее схем в процессе лечения.

Выделение M. tuberculosis и определение ЛЧ к основным ПТП в среде М 7Н9 в среднем занимает 21день, в то время как на плотной питательной среде Л-Й время оборота исследования требует в среднем 68 суток, т. е. в 3,2 раза больше (таблица 7).

Таблица 7.

Скорость выделения и определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза на разных питательных средах (n=180)

Параметры роста M. tuberculosis	Скорость роста на питательной среде (сутки)	t-критерий P
Миддлбрука 7Н9, M+m	Левенштейна-Йенсена, M+m
Средняя скорость выделения культуры	12,95 + 1,4	45,62 + 4,7	<0,05
Средняя скорость определения ЛЧ к основным ПТП	8,49 + 1,1	22,75 + 2,4	<0,01
Полное микобактериологическое исследование (от посева до получения результатов ЛЧ)	21,44 + 2,3	68,37 + 6,1	<0,01

Немаловажным преимуществом автоматизированной системы является возможность определения ЛЧ культур МБ к пиразинамиду, т. к. критические концентрации пиразинамида на плотных питательных средах до настоящего времени не установлены.

Результаты определения чувствительности к основным ПТП в АС клинических штаммов M. tuberculosis, выделенных от всех категорий больных, находившихся на лечении в ПТД г. Москвы и в стационаре МНПЦБТ, полученные в гг., указывают на рост доли числа устойчивых культур. Если в 2005 году выделено 46,7% устойчивых к стрептомицину культур МБТ, 53,4% –устойчивых к изониазиду, 33,0% – к рифампицину и 8,2% – к этамбутолу, то в 2009 г. удельный вес таких культур увеличился до 60,8%; 54,5%; 45,1% и 41,3% соответственно.

Особую тревогу у клиницистов вызывает постоянное увеличение количества штаммов M. tuberculosis, имеющих множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). В 2005 году протестировано на чувствительность к основным ПТП 509 клинических штаммов, выделенных от больных туберкулезом как впервые выявленных, так и с хроническими формами заболевания. Из них ,2%) имели МЛУ. В 2006 г. удельный вес штаммов, имеющих МЛУ, составил уже 34,2%, в 2007 г. – 44,3%, в 2008 г. – 41,5%, а в 2009 г. – 45,8%. С 2005 по 2009 год наблюдали повышение доли штаммов с МЛУ в 1,4 раза. В целом, при изучении клинического материала, полученного у впервые выявленных больных туберкулезом за период гг., количество штаммов МБТ, обладающих МЛУ составило 7,7%, широкой лекарственной устойчивостью - 1,9% от общего числа выделенных культур.

С целью обоснования применения МГМ (ТБ-БИОЧИП) для быстрого определения наличия МЛУ у штаммов МБТ, находящихся в патологическом материале, исследован диагностический материал, полученный от 738 пациентов параллельно культуральным методом в АС и МГМ с применением тест-системы ТБ-БИОЧИП. Сравнивали данные исследования 272 образцов диагностического материала, из которых выделена культура МБТ в АС и подтверждено ее наличие в образце с помощью ТБ-БИОЧИПа. У 167 определена чувствительность к основным ПТП, у 105 – устойчивость как к отдельным препаратам, так и к их комбинации (МЛУ).

Проведенное исследование показало, что данные, полученные в результате определения ЛЧ культуральным методом в автоматизированной системе и МГМ, сопоставимы (таблица 8).

Таблица 8.

Результаты изучения лекарственной устойчивости M. tuberculosis

к основным ПТП, в жидкой питательной среде 7Н9

и с помощью ТБ-БИОЧИПа

Устойчивость к противотуберкулезным лекарственным препаратам	Количество устойчивых штаммов, обнаруженных с помощью	Всего
среды 7Н9	ТБ-БИОЧИПа	ТБ-БИОЧИПа+ среды 7Н9
абс	%	абс	%	абс	%	абс	% от всех обнаруженных штаммов
изониазиду	3	16,7	12	66,7	3	16,7	18 (100,0%)	6,6
рифампицину	1	16,7	4	66,7	1	16,7	6 (100,0%)	2,2
рифампицину+ изониазиду (МЛУ)	17	21,0	15	18,5	49	60,5	81 (100,0%)	29,8
ИТОГО:	21	20,0	31	29,5	53	50,5	105 (100,0%)	38,6

Вместе с тем следует отметить, что применение биологических микрочипов для исследования диагностического материала сокращает время обнаружения возбудителя и определения его ЛЧ до 48 часов по сравнению с аналогичными исследованиями, проведенными даже в жидкой питательной среде в АС (в среднем 21 день).

В процессе выполнения данной работы в биологических пробах обнаруживали нетуберкулезные микобактерии, которые выделяли как в смеси с M.tuberculosis, так и в монокультуре, и которые оказывают существенное влияние на течение основного заболевания и его исход. Поэтому не менее важное значение имеет изучение чувствительности выделенных в г. Москве штаммов НТМБ к ПТП и ряду других антибактериальных препаратов, которое показало, что все штаммы НТМБ обладали высокой степенью ЛУ к основным ПТП (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол): 42,9% медленнорастущих и 83,6% быстрорастущих НТМБ. МЛУ (к изониазиду и рифампицину) установлена в 52,6% случаев у медленнорастущих НТМБ и в 86,8% случаев у быстрорастущих МБ. Широкая лекарственная устойчивость (МЛУ плюс ЛУ к фторхинолонам и аминогликозидам) у медленнорастущих НТМБ отсутствовала, а у быстрорастущих установлена в 3,1% случаев (исследование проводили методом абсолютных концентраций на среде Л-Й).