Диагностика туберкулеза в современной централизованной микобактериологической лаборатории г. Москвы (стр. 1 )

На правах рукописи

ФРЕЙМАН

Георгий Ефимович

ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА В СОВРЕМЕННОЙ

ЦЕНТРАЛИЗОВАННОЙ МИКОБАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ

ЛАБОРАТОРИИ г. МОСКВЫ

03.02.03 – микробиология

14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы (МНПЦБТ), г. Москва.

Научные руководители: доктор биологических наук

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук

Ведущая организация: Центральный научно-исследовательский

институт туберкулеза Российской академии

медицинских наук (ЦНИИТ РАМН), г. Москва

Защита состоится “15” марта 2012 года в _____ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. » Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 0.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. » Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 0.

Автореферат разослан “ ___” _______ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Быстро прогрессирующее увеличение числа случаев туберкулеза с лекарственной устойчивостью (ЛУ) возбудителя к противотуберкулезным препаратам (ПТП) и, особенно, с множественной (МЛУ) лекарственной устойчивостью является чрезвычайно серьезной проблемой здравоохранения ( и др., 2005; и др. 2008; , , 2008; Heifets L., Desmond E., 2005; Monedero I., Caminero J., 2009; Small P., 2009; Jassal M., Bishai W., 2009). ВОЗ рекомендовала для лабораторных служб в рамках Национальной программы борьбы с туберкулезом считать первоочередной задачей выявление заразных случаев туберкулеза легких, унификацию методов бактериологических исследований, а объединение лабораторий осуществлять на основе стандартизованных методик (ВОЗ, 1998г). Эти рекомендации были учтены в руководящих документах (приказ МЗ РФ от 01.01.2001г.) и Национальном руководстве (п/р , 2007г.). Кроме того, в последние десятилетия значительно увеличилось количество микобактериозов – патологии, вызываемой нетуберкулезными микобактериями (НТМБ), что в значительной степени связано с улучшением их диагностики, которую в большинстве случаев проводят противотуберкулезные учреждения (, , 2005; и др., 2008; Heifets L., 2005; Griffith D. et al., 2007; Thomson R. Сhanging, 2010; Winthrop K., 2010). Учитывая это, лабораторные микробиологические и молекулярно-генетические методы занимают значительное место в комплексной диагностике туберкулеза и микобактериозов и контроле за эффективностью лечения этих заболеваний.

Широко используемые в настоящее время классические методы выделения, идентификации микобактерий (МБ) и определения их лекарственной чувствительности (ЛЧ) занимают длительное время. В связи с этим, врачи – фтизиатры, не дожидаясь результатов бактериологических исследований ЛЧ, вынуждены назначать эмпирические режимы химиотерапии, которые не всегда оказываются адекватными.

Таким образом, на современном этапе развития эпидемического процесса туберкулезной инфекции является актуальным снижение (по времени) сроков выделения, идентификации, определения лекарственной чувствительности микобактерий с последующим применением эффективных схем профилактики и лечения туберкулеза и микобактериозов.

В сложившихся условиях эффективность борьбы с туберкулезом и микобактериозами в значительной степени определяется разработкой и внедрением новых принципов и комплекса методов бактериологических и молекулярно-генетических исследований, а также совершенствованием организационных мероприятий ( и др., 2006; и др., 2005; Albert H. et al., 2002; Bardarov S. et al., 2003; Drobniewski F. et al., 2005; Dorman S., 2010; Gupta S. et al., 2010).

В связи с вышеизложенным, представлялось перспективным в условиях функционирования крупного мегаполиса (г. Москва) организовать централизованную микобактериологическую лабораторию, оснастить ее современным медицинским оборудованием и приборами, на основе которых, используя передовые молекулярно-генетические методы экспресс-диагностики, значительно сократить сроки выделения, идентификации и определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза. Это, в свою очередь, позволит внедрить новые более эффективные схемы профилактики и лечения туберкулеза.

Цель исследования - в условиях крупного мегаполиса создать централизованную микобактериологическую лабораторию для внедрения и использования комплекса современных ускоренных бактериологических и молекулярно-генетических методов выделения, идентификации и определения лекарственной устойчивости микобактерий.

Задачи исследования

1. Оценить эпидемиологическую ситуацию по туберкулезу как основу для определения потребности в микобактериологических исследованиях с использованием автоматизированных систем.

2. Апробировать и поэтапно внедрить в практику централизованной микобактериологической лаборатории г. Москвы унифицированный единый алгоритм обследования пациентов с целью ранней диагностики туберкулеза, дифференциации его от микобактериозов и определения ЛЧ возбудителя.

3. Провести сравнительное изучение наиболее широко применяющихся в мировой практике методов выделения, идентификации и определения ЛЧ микобактерий.

4. Изучить спектр лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза (МБТ) и НТМБ, проанализировать частоту и сроки обнаружения множественной и широкой лекарственной устойчивости возбудителя у впервые выявленных больных туберкулезом в г. Москве.

5. Обосновать в соответствии с рекомендациями ВОЗ централизацию, как наиболее оптимальную форму организации микобактериологических исследований, позволяющую усовершенствовать диагностику туберкулеза и микобактериозов в условиях г. Москвы.

Научная новизна

Проведенный в условиях централизованной микобактериологической лаборатории г. Москвы сравнительный анализ эффективности существующих стандартных бактериологических и молекулярно-генетических методов выделения, идентификации и определения лекарственной чувствительности МБ позволил разработать схему лабораторной диагностики туберкулеза, представляющую собой алгоритм раннего выделения возбудителя, значительно сократившего сроки получения результатов, тем самым, оптимизировать диагностику и лечение микобактериальных инфекций.

Показаны различия лекарственной чувствительности МБТ и НТМБ, выделенных из клинического материала, проведен мониторинг широкой лекарственной устойчивости и установлено, что частота выделения из диагностического материала возбудителя туберкулеза, обладающего множественной лекарственной устойчивостью 7,7%, широкой лекарственной устойчивостью, не превышает 1,9% случаев.

На основе новых данных, выполняя рекомендации ВОЗ, доказана целесообразность и необходимость централизации микробиологических исследований в условиях г. Москвы, дающей возможность эффективно использовать современное высокотехнологичное оборудование, ускоренные и стандартизованные методы микобактериологических и молекулярно-генетических исследований, что позволяет решить ключевую задачу стратегии ВОЗ в лечении туберкулеза. Разработана унифицированная методика расчета потребности в микобактериологических исследованиях материала на жидких питательных средах в год для пациентов, нуждающихся в ускоренном обследовании. В отличие от предшествующих, данная методика включает расчет для обследования впервые выявленных больных и рецидивов заболевания, а также больных, требующих дифференциальной диагностики легочного заболевания, с учетом определения лекарственной чувствительности возбудителя к противотуберкулезным препаратам.

Практическая значимость работы

Разработан оптимальный комплекс (алгоритм) методов диагностики микобактериальных инфекций для централизованной бактериологической лаборатории (ЦБЛ) г. Москвы, позволяющий осуществлять быстрое и раннее выявление наиболее опасной категории пациентов – бактериовыделителей, идентифицировать вид выделенных штаммов КУМ с определением ЛУ для своевременной корректировки противотуберкулезной терапии.

Проведенные исследования показали преимущества централизации микобактериологической диагностики, выражающиеся в сокращении сроков выявления и выделения возбудителя туберкулеза и микобактериозов, определения его вида и ЛЧ к ПТП, оптимизации расходов для их проведения и увеличении числа исследований, проводимых по единому протоколу, применении унифицированных и введении в процесс лабораторной диагностики дополнительных ускоренных стандартизованных методов и современного высокотехнологичного оборудования, увеличении числа обслуживаемых противотуберкулезных учреждений.

Разработана для централизованной микобактериологической лаборатории г. Москвы лабораторная автоматизированная компьютерная программа на основе Лабораторной информационной системы для учета и анализа результатов исследования.

Созданы единая интегрированная полицевая база данных на бактериовыделителей и банк данных о штаммах НТМБ и M.tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью к ПТП, выделенных от впервые выявленных больных, которая позволяет мониторировать состояние ЛЧ на территории г. Москвы у конкретного пациента.

Разработан способ расчета потребности в диагностических микобактериологических исследованиях материала на жидких питательных средах в год для пациентов, нуждающихся в ускоренном обследовании, позволяющий обосновать потребность в автоматизированных системах.

Внедрение результатов работы в практику

Разработанный алгоритм раннего выявления бактериовыделителей, ускоренного выделения и определения ЛЧ микобактерий расширяет возможности бактериологической диагностики туберкулеза и микобактериозов в работе ЦБЛ Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом и использован для оптимизации работы микобактериологических лабораторий в городах-мегаполисах России.

В период с 2005 по 2007 годы целесообразность функционирования ЦБЛ для диагностики туберкулеза в мегаполисе была доказана на основе использования алгоритма при проведении диагностических исследований на туберкулез населения более 1 млн. человек. В гг. данное обоснование было подтверждено путем дальнейшего расширения обслуживаемой территории г. Москвы с населением более 7,6 млн. человек, внедрения новых методов исследования и включения нового технологического оборудования.

Результаты проведенных исследований по изучению возбудителя микобактериозов включены в методические рекомендации №19 «Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами», утвержденных Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009г.

В 2012 году МНПЦБТ готовит к изданию пособие «Лабораторная диагностика туберкулеза и микобактериозов», в отдельном разделе которого обобщен опыт создания ЦБЛ в г. Москве с учетом концепции ВОЗ и международных требований стандартизации бактериологических исследований.

Материалы исследования включены в курс лекций и практических занятий на кафедре фтизиатрии ГБОУ ДПО РМАПО Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Положения, выносимые на защиту

1. Централизация является наиболее целесообразной формой организации микобактериологических исследований в условиях г. Москвы, позволяющей эффективно использовать оборудование и реактивы, осуществлять исследования с применением современных стандартизованных методов по единому протоколу.

2. Использование в исследовании автоматизированных анализаторов на основе применения жидких питательных сред для культивирования биологического материала и определения лекарственной чувствительности возбудителя позволило выделить на 12% больше число штаммов микобактерий туберкулеза, на 22,9% - нетуберкулезных микобактерий и в 3,2 раза сократить сроки получения результатов.

3. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии и БИОЧИПов позволяет получить результаты видовой идентификации микобактерий в течение 48 часов по сравнению с микробиологическими методами.

4. Разработанный алгоритм микробиологического и молекулярно-генетического обследования пациентов в условиях ЦБЛ г. Москвы для ранней диагностики микобактериальных инфекций и определения ЛЧ возбудителя к ПТП позволил сделать более эффективной диагностику туберкулеза.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета МНПЦБТ с участием сотрудников кафедры фтизиатрии ГБОУ ДПО РМАПО Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, протокол от 8 сентября 2011 года.

Материалы диссертации представлены на научно-практических конференциях на VIII Всероссийском съезде фтизиатров (Москва, 2007); VI и VIII Московской Ассамблее «Здоровье столицы» (Москва, 2007, 2009); II Научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных заболеваний, лабораторный анализ» (Москва 2009), заседаниях Ученого совета МНПЦБТ;

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 статья – в других изданиях, 3 - в сборниках научных трудов, 6 – в материалах съездов и конференций, 1 - методические рекомендации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, главу, посвященную материалам и методам исследований, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 4 рисунками. Список использованной литературы включает 146 источников, в том числе 33 отечественных и 113 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. За период с 2005г. по 2009г. обследовано 12248 пациентов, выявлено 4012 бактериовыделителей (32,75%), выполнен 441131 посев 207656 проб патологического материала, в том числе 35878 – на жидких питательных средах от пациентов и больных из восьми ПТД г. Москвы, стационара и Консультационного отделения МНПЦБТ. Из 12919 проб выделена культура M. tuberculosis, из 742 проб - НТМБ. С помощью МГМ исследовано 16594 штамма и 748 штаммов - с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Клинические штаммы выделялись из мокроты, экссудатов, промывных вод и аспирата из бронхов, послеоперационного материала. Лаборатория является участником Федеральной системы внешней оценки качества. Источники данных - статистические формы учета (ф.33, ф.8).

Микробиологические методы исследования. Патологический материал, полученный от обследуемых лиц, перед посевом в жидкую (Миддлбрук 7Н9 в автоматизированной системе) и на плотную Левенштейна-Йенсена (Л-Й) питательные среды подвергали деконтаминации, концентрации и исследовали методом люминесцентной микроскопии на наличие кислотоустойчивых микроорганизмов.

Принадлежность выделенных штаммов микобактерий к МБТ или НТМБ и идентификацию до вида подтверждали культуральными и биохимическими методами в соответствии с действующими рекомендациями.

Определение ЛЧ клинических штаммов МБ к ПТП основного ряда проводили в жидкой питательной среде в автоматизированной системе, а к препаратам резервного ряда и фторхинолонам – на среде Л-Й. В качестве контроля использован лекарственно-чувствительный вирулентный стандартный штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC № 000 из коллекции МНПЦБТ.

Молекулярно-генетические исследования. Материал от впервые выявленных больных, лиц с подозрением на туберкулез или развитие рецидива заболевания с целью раннего обнаружения МБТ и мутаций, ответственных за устойчивость к изониазиду и рифампицину, исследовали с помощью ТБ-БИОЧИП (МЛУ), а к фторхинолонам - ТБ-БИОЧИП-2. Применяя экспериментальную версию биологических микрочипов «IMS», метод ВЭЖХ по методике, предложенной CDC (США, 1996 г.) идентифицировали МБ туберкулезного комплекса от НТМБ. Тест-системы с использованием биологических микрочипов разработаны Институтом молекулярной биологии им. РАН совместно с МНПЦБТ. Апробация и клиническая адаптация проводилась нами в отделе проблем лабораторной диагностики туберкулеза на штаммах, выделенных в бактериологической лаборатории.

Программное обеспечение. Для автоматизации работы применялась специально разработанная для ЦБЛ отделом «Лабораторные Информационные Системы» ГАЛЕН» лабораторная информационная система «АЛИСА», объединившая микобактериологические и молекулярно-генетические исследования.

Статистическую обработку и анализ данных проводили с помощью компьютерных программ Microsoft®Office Excel 2003.Оценку достоверности различий качественных признаков и долей в группах проводили с использованием критерия Фишера (для двух параметров) и χ2-критерия (для трех и более параметров), определяли среднее значение, его стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Эпидемиологическая ситуация, как показатель необходимости централизации микобактериологических исследований

В качестве модели обследования населения городов-мегаполисов для разработки алгоритма ускоренного выявления наиболее опасной категории больных – бактериовыделителей на первом этапе проведено исследование в Восточном Административном округе (ВАО) г. Москвы, на территории которого проживает 1380500 человек. Противотуберкулезную помощь населению округа под руководством МНПЦБТ осуществляют три ПТД: № 8, обслуживающий 424700 чел., № 17 – 396300 чел., № 21 – 559500 чел. Исследования проводили в два этапа.

1-й этап исследования продолжался в течение 3-х лет ( гг). Для расчета количества необходимых анализов использовали данные о численности населения, определенной во время переписи 2002 года, и эпидемиологических показателей по туберкулезу. Показатели заболеваемости туберкулезом в годы, предшествующие началу исследований, на 100 тыс. населения по г. Москве: в 2003г. – 47,3, 2004г. – 43,4, в том числе постоянных жителей в 2003 г. – 29,1, в 2004г. – 30,8. Заболеваемость бациллярным туберкулезом на 100 тыс. населения составила в 2003г. – 11,7, в 2004г. – 12,4, в том числе по ВАО, в 2003г. – 12,5, в 2004г. – 14,9. Контингенты больных активным туберкулезом на 100 тыс. населения в 2003 г. – 105,0, в 2004г. – 96,0, в том числе по ВАО, в 2003г. – 105,1, в 2004г. – 98,7. С учетом показателей, кратности рекомендуемого обследования (Приказ № 000 МЗ РФ от 01.01.2001г.) произведен расчет необходимого количества анализов (на примере ВАО) в год (таблица 1).

Таблица 1.

Расчет потребности в микобактериологических исследованиях

в год для групп пациентов, нуждающихся в обследовании на жидких питательных средах (на примере ВАО), на 2005 г.

Показатели:	Категории больных	Всего
впервые выявленные	диагности-ческие	подозрение на рецидив
А-число пациентов, абс	191**	315	27	533
B-коэффициент культуральных исследований в год на 1 пациента (приказ № 000)	5	3	5	13
C-число посевов диагностического материала в год, абс	955	945	135	2035
D-число бактериовыделителей, абс #	97**	35	27	159
E-число исследований ЛЧ в год (7 исследований на 1 больного) *	679	245	189	1113
F-общее число необходимых исследований в год	1634	1190	324	3148

# – по результатам культурального исследования за 2004 г.