Клональное микроразмножение и депонирование перспективных форм груши (стр. 1 )

На правах рукописи

Клональное микроразмножение
и депонирование перспективных
форм груши

Специальность 06.01.01 - общее земледелие

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата

сельскохозяйственных наук

Орёл – 2012

Диссертация выполнена в государственном научном учреждении
Всероссийский научно-исследовательский институт селекции
плодовых культур Россельхозакадемии в гг.

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Павловская Нинэль Ефимовна

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений имени

Защита диссертации состоится 6 марта 2012 года в 1430ч. на заседании диссертационного совета ДМ 220.052.01 в Орловском государственном аграрном университете по адресу: 302019 9.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки ОГАУ (г. Орел, Бульвар Победы 19)

Автореферат разослан « 3 » февраля 2012г. и размещен на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет» http://www.orelsau.ru и сайте ВАК при Минобрнауки РФ http://vak.ed.gov.ru.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета ДМ 220.052.01.

Факс 8 (486, e-mail: [e-mail]

Ученый секретарь диссертационного

совета, доктор с.-х. наук, профессор

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Груша является одной из важнейших плодовых культур средней полосы России. Однако в последние годы наблюдается резкое сокращение площадей данной культуры. Главные причины такого положения связаны, в основном, с отсутствием высокозимостойких сдерживающих рост подвоев, плохой фитосанитарной обстановкой, недостатком посадочного материала современных сортов, отсутствием маточно-сортовых насаждений и технологий получения оздоровленного привойного материала. Решению этих проблем может помочь применение методов размножения in vitro, которые широко используются при размножении и оздоровлении ягодных культур (Al Maanri, Duson, Arnand, Mlgimal, 1986, Туровская, , 1990, Свириденко, Бурдалов, Дудченко, 1991, Семенас, Кухарчик, 2000).

В связи ускорением темпов селекционного процесса по созданию новых генотипов, а также создания коллекций ценных форм растений важной задачей является разработка эффективных способов сохранения генетических ресурсов. Депонирование при пониженных положительных температурах позволяет поддерживать жизнеспособность микрорастений в течение длительного времени. В результате этого на сравнительно небольшой площади можно разместить большое количество ценного генетического материала.

У ряда культур, в том числе и у груши, этапы укоренения и адаптации связаны с определенными трудностями. Так, при индукции ризогенеза отдельные генотипы образуют недоразвитую корневую систему либо не образуют вовсе и наблюдается массовая гибель микрорастений. Особый интерес при решении проблем укоренения и адаптации к нестерильным условиям представляет изучение эффективности методов иммуностимуляции и прививки микропобегов из культуры in vitro на сеянцы груши, выращенные в условиях in vivo.

Цель и задачи исследований. Цель исследований – разработка эффективных приемов клонального микроразмножения и длительного депонирования пробирочных растений груши.

В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

1) найти наилучший стерилизующий агент для груши;

2) подобрать минеральную основу питательных сред;

3) определить тип, концентрацию и сочетание регуляторов роста для каждого этапа культивирования;

4) изучить способы адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям;

5) изучить возможность прививки материалом in vitro трудноукореняемых форм на семенные подвои;

6) изучить состав сред и условия культивирования для длительного хранения пробирочных растений.

Научная новизна исследований

Впервые в условиях региона проведено детальное изучение клонального микроразмножения сортов и форм груши различного генетического происхождения. Выявлены оптимальные способы стерилизации эксплантов груши. На всех этапах микроразмножения показано и обосновано влияние на рост и развитие микрорастений груши химического фактора и сортовых особенностей. С учетом этих факторов подобран оптимальный состав питательных сред для этапов введения в культуру, пролиферации и укоренения эксплантов груши. Прослежено изменение коэффициента размножения и развития груши в зависимости от концентраций БАП и от комбинаций ауксинов, цитокининов и гибберелловой кислоты (ГК). На этапе укоренения исследован процесс образования корней и влияние сортовых особенностей на интенсивность корнеобразования. На этапе адаптации к нестерильным условиям показана возможность применения препаратов группы элиситоров – Экост 1/3 и Эль-1, и их сочетания. Изучен процесс прививки микропобегов груши на семенные подвои в системе ускорения производства посадочного материала некоторых сортов и трудноукореняемых форм груши. Впервые проведено изучение длительного депонирования эксплантов груши при пониженных температурах. Определены оптимальные сроки хранения и состав питательных сред для данного процесса, подобраны концентрации БАП и сахарозы.

Практическая значимость исследований

Создана теоретическая база для разработки технологии хранения и ускоренного получения оздоровленного посадочного материала груши.

Разработан способ депонирования сортов и форм груши in vitro в виде микропобегов для сохранения генетических коллекций.

Определены возможности использования микропобегов в качестве привойного материала для производства оздоровленных саженцев груши.

Разработан способ ускорения производства оздоровленного посадочного материала трудноразмножаемых сортов груши.

Определено влияние различных биологически активных веществ на адаптацию растений груши при выводе из условий in vitro и особенности их применения.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на международной научно-методической конференции «Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве», Орел, 28-31 июля 2003, на научно-методической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы садоводства в России и пути их решения», Орел, 2-5 июля 2007 года, на международной научно-практической конференции «Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве», Москва, 22-23 июня 2011, на заседаниях лаборатории биотехнологии, отдела селекции семечковых культур, ученого совета ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии, ученом совете ГНУ ВНИИСПК Россельхозакадемии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 в рецензированных изданиях, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах, стоит из введения, обзора литературы, главы с описанием методов исследований, главы, содержащей результаты исследований и обсуждений, выводов, рекомендаций для практического использования, акта о внедрении в производство, списка литературы и приложений.

Работа содержит 35 таблиц и 30 рисунков. Список использованной литературы состоит из 213 наименований, в том числе 84 – на иностранных языках.

Основные положения, выносимые на защиту:

- сортовая реакция эксплантов груши на обработку стерилизующими агентами на этапе введения культуру in vitro и на минеральный состав питательных сред на этапе введения культуру in vitro и на этапе микроразмножения;

- ризогенез микропобегов груши в зависимости от минерального состава сред, типа индуктора корнеобразования и способа его аппликации;

- эффективность применения препаратов элиситорного действия при адаптации растений груши к нестерильным условиям;

- технологические приемы получения посадочного материала груши методом микропрививки;

- оптимизация способов депонирования побегов груши в условиях минимального роста.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2 Объекты, методика и условия проведения экспериментов

Исследования проводили на базе ГНУ ВНИИСПК в рамках программы фундаментальных и приоритетных исследований по научному обеспечению развития АПК Российской федерации. Растительный материал для выполнения работы был предоставлен сотрудниками лаборатории селекции груши и нетрадиционных семечковых культур доктором с.‑х.­­­ наук и кандидатом с.-х. наук

Для более полной характеристики рода Pyrus L. в качестве объектов исследований взяты сорта и формы селекции ГНУ ВНИИСПК и Московской сельскохозяйственной академии им. , в происхождении которых участвовали 4 вида (P. communis L., P. ussuriensis Maxim., P. betulifolia Bunge, P. bretschneideri Rehd.), условно объединённые по происхождению на группы:

1. P. communis L.: Орловская летняя, Восковка, сеянцы 1, 2, 4;

2. munis L. × P. ussuriensis Maxim.:

F2 – Лада;

F3 – Есенинская, Муратовская, ;

F4 – Тютчевская, Аннушка

3. P. ussuriensis Maxim. – Груша уссурийская

4. P. betulifolia Bunge – Груша берёзолистная

5. P. communis L. × P. bretschneideri Rehd.: 40-4 (Бретфелпс-апомикт).

Для стерилизации эксплантов использовали растворы 0,1%-го мертиолата, 0,1%-й сулемы, 0,01%-го йода, а так же сочетание перекиси водорода и сулемы. Экспланты брали с однолетних побегов в период начала активного роста. Длительность субкультивирования – 3-4 недели. Учеты проводили по окончании данного срока.

Стерилизацию эксплантов проводили в 2 этапа: 1) промывка эксплантов под проточной водой в течение двух часов; 2) обработка 70% этанолом (5-10 секунд) и стерилизующим агентом в течение 8–10 минут с последующей промывкой в стерильной воде три раза по пять минут.

Стерилизацию перекисью водорода проводили по следующей схеме: промывка эксплантов под проточной водой в течение двух часов, обработка смесью 30% перекиси водорода и 96% этанола в соотношении 1:1 в течение 10 секунд, обработка 0,1%-м раствором сулемы 8-10 минут с последующей промывкой в стерильной воде три раза по пять минут.

На этапах введения и микроразмножения использовали среды Мурасиге-Скуга, Ли и де Фоссарда, Гамборга, Пиерика и Мак Коуна. На этапе пролиферации использовали концентрации БАП – 0,5 мг/л, 1,0 мг/л, 2,0 мг/л, 3,0 мг/л., сочетания БАП и ИМК, сочетания БАП и ГК, и БАП, ИМК и гибберелловой кислоты (ГК).

Для этапа укоренения были апробированы все выше перечисленные питательные среды, а также среда Уайта и среда Мурасиге-Скуга с разбавленной вдвое минеральной основой.

Были испытаны сочетания различных ауксинов (ИМК, ИУК, НУК) и способы их аппликации: введение в питательную среду, замачивание в стерильном спиртовом и водном растворах ИМК, обработка пудрой на основе талька с последующим переносом микропобегов на питательную среду без регуляторов роста.

Было испытано влияние препаратов элиситорного действия (Экост 1/3 и Эль-1) на приживаемость растений груши in vitro в период адаптации к нестерильным условиям.

Для изучения длительного хранения груши in vitro использовали среду МС с разбавленной минеральной основой в 2, 4, 8 раз, пониженной концентрацией сахарозы в 2, 4, 8 раз, а также на фоне различных концентраций маннита (1; 2; 5 мг/л) и цитокинина (БАП – 0,1; 3; 5; 10 мг/л).

Форма хранения – единичные побеги.

В экспериментах по разработке приемов микропрививки в качестве привоя использовали побеги сортов Лада и Тютчевская и гибрида 40-4, выращенные в условиях in vitro. В качестве подвоя брали сеянцы груши, выращенные в нестерильных условиях. Способ прививки – в расщеп. Подвой брали в возрасте одного года, толщина которого не менее 3 мм в диаметре. Для лучшего срастания срезы подвоя обрабатывали антиоксидантами – аскорбиновой кислотой в концентрации 50 мг/л и диэтилдитиокарбоматом натрия (ДИЕКА) – 2 г/л, а так же ИМК в концентрации 25 мг/л.

Статистическую обработку данных проводили по методикам (1985), и др. (1997) и (Высоцкий, 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3 Влияние режимов стерилизации на этапе введения эксплантов груши в стерильную культуру

Эффективность освобождения эксплантов от инфекции и их дальнейшее развитие зависят от типа стерилизующего агента, а также сортовых особенностей.

При введении в культуру эксплантов груши минимальный средний процент заражения был получен при использовании 0,1%-го раствора мертиолата и составил 5,7. Максимальный уровень инфицированности апексов отмечали при обработке меристем 0,01%-м раствором йода – 23,6%. При стерилизации смесью перекиси водорода и 96%-ного этанола с последующей обработкой 0,1%-м раствором сулемы заражение составило 8,3%. Использование 0,1%-го раствора сулемы дало 12,8% заражения.

Средняя приживаемость эксплантов колебалась от 57,6% до 72,4%. Устойчивостью к действию всех стерилизующих препаратов отличались экспланты сортов Лада, Тютчевская и Аннушка. Низкую жизнеспособность апексов независимо, от применяемого агента отмечали у подвоев Восковка и груши 1, вида уссурийская, сортов Муратовская и Есенинская, гибрида .

Применение смеси перекиси водорода (30%) и 96%-ного этанола с последующей обработкой раствором сулемы (0,1%), а также 0,1%-го раствора мертиолата обеспечивает практически полное освобождение эксплантов от инфекционного начала и не вызывает некроза тканей, что дало возможность получить больше материала для этапа микроразмножения.

4 Определение наилучшей минеральной основы сред на этапе
введения эксплантов груши в стерильную культуру

На этапе введения в культуру среды Мурасиге-Скуга (МС) и Пиерика оказались более эффективными для развития эксплантов большинства сортов и форм, где приживаемость достигала 74,5% и 72,2% соответственно. На среде Ли и де Фоссарда приживаемость составила 68,4%. Данная среда вызывала также быстрое развитие апексов. Минимальное количество эксплантов выжило на среде Мак Коуна – 42,7%.

При подборе питательных сред были выявлены проявления генетических особенностей форм груши. Так, экспланты сортов Тютчевская, Аннушка, гибрида и подвоя груша 4 отличались высоким уровнем приживаемости практически на всех средах. Сорт Орловская летняя, подвои Восковка и груша 1, груша уссурийской были избирательны к составу питательных сред. Так, у груши уссурийская только на среде МС был получен лучший результат – 41% развившихся апексов.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что на этапе введения в культуру следует использовать среды Мугасиге-Скуга, Пиерика и Ли и де Фоссарда с учетом требований различных генотипов к элементам питательной среды.

5 Влияние минерального состава питательных сред
на микроразмножение груши

На коэффициент размножения побегов груши оказали влияние два фактора – состав питательных сред и генотип. На контрольной среде Мурасиге-Скуга максимальный коэффициент размножения был получен у сортов Тютчевская (7,8), Орловская летняя (3,7) и у груши березолистной (5,3). На среде Ли и де Фоссарда высокая степень пролиферации отмечена у сортов Лада (3,2), Тютчевская (7,2), гибрида 40-4 (3,7) и груши Березолистная (5,1). На среде Пиерика коэффициент размножения у подвоя груши 4 составил 4,2, у гибрида – 4,8, у сорта Аннушка – 5,2 (табл. 1).

На росте побегов груши в длину также сказались генетические особенности каждой формы. Так, у сорта Тютчевская, груши березолистной и у подвоя груша 4 на среде Гамборга была получена максимальная длина побегов. Среда Ли и де Фоссарда стимулировала рост побегов в длину у сортов Лада, Аннушка, Тютчевская, у груши березолистной, у груши 4 и гибрида (таб. 2).

Таблица 1 - Коэффициент размножения у эксплантов различных сортов и форм груши в зависимости от минерального состава питательных сред

Сорт, форма	Питательная среда
Гамборга	Пиерика	Ли и де Фоссарда	Мак Коуна	Мурасиге-Скуга (контроль)
Тютчевская	6,6±1,3	6,7±1,1	7,2±2,7	4,2±0,4	7,8±1,9
Орловская летняя	3,1±0,3	3,0±0,3	3,0±0,4	2,1±0,3	3,7±0,6
Лада	3,2±0,3	2,6±0,2	3,2±0,3	2,2±0,4	2,4±0,4
Аннушка	4,4±0,6	5,2±0,8	4,5±0,7	2,9±0,4	4,8±1,2
40-4	2,9±0,3	3,1±0,3	3,7±0,6	1,5±0,2	3,3±0,9
Груша березолистная	3,7±0,6	4,0±0,4	5,1±1,0	3,2±0,3	5,3±1,2
Груша 4	2,8±0,3	4,2±0,5	2,9±0,5	2,6±0,3	2,6±0,5
	3,8±0,7	4,8±0,8	3,9±0,6	-*	2,8±0,7
НСР05=1,5 для гибрида между средами. Для других сортов и форм Fф<F05

* - здесь и далее отсутствие данных.