Біотехнологія в рослинництві (стр. 2 )

Враховуючи те, що в природних умовах на поверхні рослин знаходиться велика кількість грибів, їх спор, бактерій, рослинний матеріал занурюють в 70% етиловий спирт: насіння на 2-3 хвилини, меристеми листя на 0,5-1 хвилину.

Для подальшої стерилізації використовують такі препарати:

1. Препарати з активним хлором (0,5-5% гіпохлорид натрію, 9% гіпохлорид кальцію, хлорамін, "білизна");

2. Ртутні препарати (0,2-0,5% розчин сулеми, діоцид, фапосепт);

3. 5-20% перекис водню, 1% бромна вода, 0,5-2% азотнокисле срібло.

Для підвищення стерилізуючого ефекту в розчини необхідно додавати незначну кількість емульгатору твін-80 або твін-крапля на 100 мл розчину).

Час стерилізації визначається експериментально і залежить від вибраної стерилізуючої речовини та об'єкту, який ми стерилізуємо.

Щоб видалити із тканин стерилізуючу речовину, промивання експланту проводять чотири рази з періодом експозиції 15 хвилин. При порушенні режиму відбувається отруєння культури, що призводить до заторможення ростових процесів або повної загибелі рослин.

У випадку значного зараження матеріалу при введенні в стерильну культуру необхідно застосувати антибіотики, їх розчини стерилізують через мембрані фільтри. Найбільш ефективним є кла - форан. Для цього матеріал, який простерилізовано та відмито зану­рюють на 3 години у водний розчин клафорану (500 мг/л), а потім висаджують на агаризоване поживне середовище, яке містить 500 мг/л клафорану і 50 мг/л канаміцину.

Перед відкриванням колби чи пробірки з поживним середо­вищем їх протирають ватою, змоченою в спирті, горловину обпалюють над полум'ям спиртівки.

Проводячи посадку експлантів, колбу треба тримати під кутом поблизу полум'я спиртівки. Після посадки ковпачок із фольги або ватну пробку обпалюють і швидко закривають ним колбу чи пробірку.

Розрізання рослин зручно проводити в чашках Петрі або на стерильних салфетках із фільтрувального паперу.

Тема 4. Визначити особливості застосування живильного середовища для культури in vitro.

План

1. Склад штучних живильних середовищ

2. Прописи живильних середовищ

1. Склад штучних живильних середовищ.

Живильне середовище — головний фактор, що обумовлює успіх біотехнологічних робіт. Основою усіх середовищ є мінеральні солі, які містять необхідні для росту рослин макро- (N, Р, К, Са, Мg, S) і мікроелементи (Fе, В, Мn, 2п, Сu, Na, Со, Мо, Сl, Nі). Крім того, до їх складу входять вітаміни, амінокислоти, фізіологічно активні речовини.

Основне завдання під час розробки середовища для культи­вування рослинних тканин in vitro — це вибір оптимальної кон­центрації іонів і їх співвідношення. Макро - і більшість мікроеле­ментів вводять до складу живильного середовища у вигляді со­лей. У середовищах — водних розчинах кожна розчинна сіль дисоціює на два іони — катіон і аніон. Рослинні клітини погли­нають кальцій, магній і калій у вигляді катіонів Са2+, Мg2+ і К+. Азот надходить у клітину у вигляді іонів NH4 або NO3, фосфор — у вигляді іонів НРО32- і Н2РО4, сірка — у вигляді іонів SO4.

2.Прописи живильних середовищ

Різноманітність біотехнологічних об’єктів, відмінності у напрямах досліджень тощо обумовили наявність численних штучних живильних середовищ, які значно або в невеликій мірі відрізняються за своїм складом. Найчастіше використовуються такі середовища:

Середовище Мурашіге—Скуга
Макроелементи	КІ	0,83
NH4 N03	1650,0	РеS04 • 7Н20	27,80
КN03	1900,0	Nа, ЕДТА · 2Н20	37,3
СаС12 • 2Н,0	440,0	Органічні добавки
МgSO4 • 7Н,0	370,0	Тіамін — НСІ	0,1
КН2Р04	170,0	Піридоксин — НСІ	0,5
Мікроелементи	Нікотинова кислота	0,5
Н3ВО3	6,2	Мезоінозит	100,0
МnS04 • 4Н20	22,3	Гліцин	2,0
СоСІ2 • 6Н,0	0,025	IOK	2,0
СuS04 • 5Н,0	0,025	Кінетин	0,2
ZnSО„ • 7Н20	8,6	Цукроза	30 000,0
Nа2Мо04 • 2Н20	0,25

Універсальне живильне середовище, що використовується для мікроклонального розмноження великої кількості видів рослин. Відома модифікація цього сере­довища для укорінення верхівок пагонів. Використовують як середовище для стадії II багатьох сільськогосподарських рослин.

Середовище Мюллєра

Макроелементи	ZnS04 • 7Н20	3,80
	1000,0	Н3ВО3	1,60
NH4NO3	1000,0	Сu(NO3)2 • ЗН20	0,35
Са(NОз)2 • 4Н20	500,0	(NН4)6 Мо702 • 4Н20	0,10
МgS04 • 7Н20	71,50	Органічні добавки
КН2Р04	300,0	Тіамін — НСІ	0,10
NaFe ЕДТА	13,20	Нікотинова кислота	0,50
КС1	65,00	Піридоксин	0,10
Мікроелементи	Мезоінозит	100,0
МnS04 • 4Н20	14,0	Цукроза	30 000,0

Модуль 2. Біотехнологічні методи для подолання несумісності

та отримання міжвидових гібридів

Тема 5. Виділення ізольованих зародків як метод отримання форм, стійких проти хвороб і шкідників.

План

1. Причини відсутності проростання насіння від міжвидових схрещувань

2. Опрацювати методику виділення ізольованих зародків як методу отримання стійких міжвидових гібридів.

3. Підготовка насіння до виділення зародків

4. Способи виділення зародків

1. Причини відсутності проростання насіння від міжвидових схрещувань

Утворення насіння при віддалених схрещуваннях супроводжується значними відхиленнями від нормально проходження процесу формування насіння. Це обумовлено, перш за все, відмінностями генеалогічного характеру, що, в свою чергу, проявляється через відмінності рівня плоїдності, розміщення і наявність генів у хромосомах, співвідношенню між кількістю хромосом материнської рослини, ендосперму і зародка тощо.

Як правило, насіння, отримане від міжвидових схрещувань, дуже різниться за розмірами, що складає 0,9-3,1 мм. Більшість насіння має шкірку, запасні поживні речовини, зародок. Водночас, кожна із складових характеризується значною мінливістю у прояві. Особливо це стосується величини і форми зародка, а також кількості поживних речовин у насінні.

Викладені та інші причини спричиняють відхилення в проростанні гібридного насіння. Це проявляється в тривалому періоді його проростання (до 30-40 днів), відсутності сходів, загибелі рослин на перших етапах росту або в значно пізніший період.

2. Опрацювати методику виділення ізольованих зародків як методу отримання стійких міжвидових гібридів.

Застосування культури in vitro як методу подолання міжвидової несхрещуваності на етапі отримання рослин після успішного запліднення зводиться до застосування двох методів: виділення зародків у молодому віці з наступним дорощуванням на штучних живильних середовищах і виділення зародків з насіння, яке тривалий час не проростає з наступним вирощуванням їх in vitro.

Згадані підходи відрізняються складом живильних середовищ, що в свою чергу обумовлено етапами розвитку насіння. При виділенні глобулярних зародків у середовище повинні входити компоненти, які б компенсували наявність певних речовин у рослині. Тобто, вони повинні бути досить складними, включаючи компоненти невизначеного складу.

Для отримання рослин з насіння, яке тривалий час не проростає, потрібні більш прості середовища. Водночас, вони повинні мати набір основних елементів живлення для рослин, а також для індукування проходження окремих процесів – фізіологічно активні речовини.

3. Підготовка насіння до виділення зародків.

Насіння, яке тривалий час знаходиться в чашках Петрі і не проростає, не потребує додаткової підготовки для виділення зародків. Коли ж виникає необхідність проведення такої роботи з сухим насінням, то для успішного виділення зародків його необхідно замочити у стерильній дистильованій воді на декілька днів для набухання.

Обов’язковою умовою успішного отримання рослин із насіння, яке тривалий час не проростає, повинна бути його стерилізація перед виділенням зародків. Це здійснюється з використанням речовин, з які описані в умовах лабораторно-практичного заняття теми №2.

4. Способи виділення зародків.

Найбільш поширеним способом виділення зародків з насіння, яке тривалий час не проростає, є обрізання шкірки насіння з трьох сторін, а також наступним відхиленням її двох складових для можливості виділення зародка. Як правило, цю роботу проводять під бінокулярним мікроскопом. При надрізанні шкірки насіння його притримують препарувальною голкою з фіксацією у місці, де знаходяться лише поживні речовини.

Тема 6. Виділення меристем картоплі і використання живильних середовищ для її культивування

План

1. Ознайомлення з підходами до оздоровлення картоплі від вірусних, бактеріальних і грибних хвороб.

2. Визначити оптимальний розмір меристеми умови підготовки матеріалу та склад живильного середовища для його культивування.

1. Ознайомлення з підходами до оздоровлення картоплі від вірусних, бактеріальних і грибних хвороб.

Кожна із сільськогосподарських культур в значній мірі потерпає від хвороб та шкідників, які не дозволяють реалізувати генетичний потенціал сорту. Серед збудників хвороб найбільш стабільний прояв мають віруси. З іншої сторони, методи звільнення організмів від вірусів, як правило забезпечують звільнення від бактерій і грибів.

Відпрацьовано декілька методів звільнення рослин від вірусної інфекції. Одним з них є метод культури ізольованої тканини. В дослідження залучали хворі рослини тютюну, про що свідчили не лише симптоми на рослинах, але й позитивна серологічна реакція на вірус F. Кусочки листків таких рослин розміщували на штучне живильне середовище Мурасіге і Скуга з 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2мл/л). Інкубація відбувалася в термостаті при відсутності світла (температура 27 0 С, відносна вологість повітря біля 55%). Отриману в результаті росту на живильному середовищі калюсну тканину пасажували чотири разу. Проростки, які при цьому утворювалися укореняли на середовищі Хеллера. Після утворення у них коріння рослини висаджували в грунт. В результаті утворилися повноцінні рослини, які не лише добре вегетували, але й давали насіннєве потомство.