Тема 11. Виділення апікальної меристеми суниці і культивування її
План
1. Виділення апікальної меристеми суниці
2. Клональне мікророзмноження суниці
1. Виділення апікальної меристеми суниці.
При культивуванні апікальних меристем суниці використовують поживне середовище з високим вмістом кінетину (0,5- 1,0 мг/л). У результаті під дією високої концентрації кінетину проходить подавлення апікального домінування верхівкової меристеми і активація пазушних меристем. Приблизно через 2 тижні після поміщення на поживне середовище ізольованої верхівкової суниці, яка складається з меристематичного купола і 1-2 листкових примордіїв, основи листочків, що розгортаються, починають біліти. Згодом з пазух показуються пучки листків, які належать брунькам, що закладалися і проростали в пазухах. У пазухах цих нових листків знову закладуться бруньки і знову проростають. Через 1-2 місяці експланти перетворюються в конгломерат великої кількості різновікових і рівновеликих бруньок з розгорнутими листками. Утворені бруньки легко відокремлюються одна від одної і кожна, будучи пересадженою на свіже поживне середовище, продовжує формувати нові пазушні бруньки, збільшуючи тим самим число точок росту, але не утворюючи коренів. Для коренеутворення бруньки потрібно пересадити на поживне середовище, яке містить ауксин.
Для проведення роботи необхідні такі матеріали та обладнання: столони різних сортів суниці; пробірки зі стерильним модифікованим поживним середовищем Мурасіге-Скуга для культивування апікальних меристем суниці, стерильні чашки Петрі, стерильний скальпель, стерильна голка, бінокулярний мікроскоп МБ-9 або лупа, стерильне предметне скло, 96%-й спирт, стерилізуючі розчини (0,1% сулеми або 0,1 % діациду), марлеві мішечки, колба на 1 л із стерильною водою, стерильні хімічні стакани (4 шт.), спиртівка, сірники.
Виділяють наступні етапи виконання роботи:
1. Ретельно промити столони суниці щіточкою в мильній воді і сполоснути чистою водою - спочатку водопровідною, а потім дистильованою.
2. Виділити скальпелем пазушні бруньки суниці, які розташовані біля основи листків. Цю операцію можна проводити поза ламінаром. Поза ламінаром на нестерильних бруньках слід також детально відпрацювати операцію вичленімшя апікальної меристеми суниці. Всю подальшу роботу, необхідно поводити тільки в ламінарі.
3. Зібрати бруньки в марлевий мішечок і занурити його для стерилізації бруньок в 0,1 %-й розчин сулеми на 6-10 хв.
4. Вийняти мішечок за нитку із стерилізуючого розчину і 5-6 разів промити в стерильній дистильованій воді. Для цього достатньо мати два стакани, в кожний з яких налити на 1/4 об'єму стерильної води. Послідовно занурити в стакани мішечок з бруньками, прополіскуючи його у воді протягом декількох хвилин. Потім воду з другого стакана злити в перший, а в другий налити стерильної води з колби і знову прополіскувати в ній мішечок з бруньками. Процедуру повторити декілька разів.
5. Стерильні бруньки перенести з мішечка в стерильну чашку Петрі.
6. Для вичленення меристем бруньку суниці помістити на стерильне предметне скло і розглянута під бінокулярним мікроскопом (лупою) при 10-разовому збільшенні.
7. З допомогою стерильної препарувальної голки і стерильного скальпеля звільнити бруньку від численних листкових лусочок.
8. Притримуючи бруньку стерильною голкою, вичленити стерильним скальпелем (стерильною бритвочкою) меристематичний купол з 1-2 листковими примордіями. Для вправного виділення меристеми потрібні відповідні навички, тому дану технологію слід спочатку добре освоїти на нестерильних бруньках суниці.
9. Вичленену меристему перенести скальпелем у пробірку з поживним середовищем Мурасіге-Скуга модифікованим для культивування апікальних меристем суниці. Горловину пробірки після її відкривання і перед посадкою меристеми слід обпалити на спиртівці.
10. Обпалити на спиртівці ватний корок, повторно обпалити горловину пробірки і закрита її корком.
11. Помістити пробірки з апікальними меристемами суниці у світлову кімнату при температурі +25°С.
12. Через 4 тижні розглянути і замалювати конгломерат бруньок, який утворився в результаті росту апікальної меристеми суниці на поживному середовищі. Відмітити кількість утворених бруньок і порівняти за цією ознакою різні сорти суниці великоплідної.
13. Конгломерати бруньок використати для наступної лабораторної роботи з індукції коренеутворення при мікроклональному розмноженні суниці.
2. Клональне мікророзмноження суниці.
Для виконання лабораторної роботи використати культуру апікальних меристем (через 3-4 тижні після початку культивування). Виділяють наступні етапи виконання роботи:
1. У стерильних умовах (у ламінарі) вийняти корок з пробірки, де культивується апікальна меристема суниці, обпалити на спиртівці горловину пробірки і стерильним пінцетом добути конгломерат бруньок.
2. Вивільнити основу конгломерату від залишків агаризованого поживного середовища, промити в стерильній воді і перенести в стерильну чашку Петрі.
3. Роз'єднати з допомогою стерильного скальпеля конгломерат на окремі бруньки.
3. Кожну бруньку з допомогою стерильного пінцета перенести в окрему пробірку з поживним середовищем для вкорінення суниці.
4. Обпалити шийку пробірки і корок, закрити пробірку корком.
5. Обгорнута целофаном (парафіном) корки пробірок і помістити в світлову кімнату з освітленістю 10 тис. люкс, температурою 26°С і вологістю 60 %.
6. Через тиждень розглянути і замалювати пробірки, відзначити початок коренеутворення. Порівняти за цією ознакою різні сорти суниці; зробити відповідні висновки.
7. Через місяць (після пересадки бруньок на середовище для вкорінення) провести наступне спостереження. У розрізі сортів виявити рослини, які можна використати для пересадки в нестерильні умови.
8. Пробіркові рослини суниці, які відзначаються хорошим розвитком і добре розвиненою кореневою системою, пересадити в ящики або горшки, наповнені сумішшю торфу і піску (співвідношення 3:1).
9. Для кращого вкорінення і приживання пробіркових рослин суниці в грунті, накрити їх ковпаком з поліетиленової плівки.
Модуль 4. Мутагенез в біотехнології
Тема 12. Ознайомлення з методикою виділення і культивування апікальної меристеми винограду
План
1. Клональне мікророзмноження винограду
Клональне мікророзмноження винограду включає наступні методи: 1) вегетативне розмноження шляхом укорінення верхівок пагонів, а також одновічкових експлантів, які були отримані при повторному живцюванні рослин, розмножених in vitro (коефіцієнт ромноження 1:4), 2) культивування вічок, верхівок пагонів з утворенням із них численних пагонів на твердому середовищі з цитокінінами (коефіцієнт розмноження 1:10), 3) проліферація пазушних вічок на рідкому поживному середовищі з цитокінінами (коефіцієнт розмноження 1:30). Найбільш високопродуктивним є спосіб проліферації пазушних вічок.
Для виконання роботи використовуються такі матеріали і обладнання: зелені пагони винограду, бінокулярна лупа, скальпелі, леза, пробірки із стерильним поживним середовищем.
Етапи виконання роботи:
1.Із зелених пагонів рослин, відокремлюють верхівки розміром 2-3 см.
2. У ламінар-боксі верхівки пагонів занурюють у стакан із 70% етиловим спиртом і витримують 30-40 с.
3. Верхівки переносять стерильним пінцетом у стакан із гіпохлоридом натрію на 8-10 хв.
4. Простерилізовані пагони промивають у стерильній дистильованій воді 4-5 раз протягом 10-15 хв.
5. За допомогою бінокулярної лупи скальпелем видаляють апікальні меристеми з листковими зачатками розміром 0,5-0,8 мм.
6. Меристеми з листковими зачатками кладуть у стерильну чашку Петрі із зволоженим фільтрувальним папером.
7. Виділені меристеми пінцетом поміщають на містки-підтримки з фільтрувального паперу в біологічні пробірки або безпосередньо занурюють в рідке середовище у конічні колби, які містять по 2-3 мм середовища.
8. В кожну пробірку або колбу висаджують по одній меристемі.
9. Культивують при температурі 23-28°С, освітленні лк, через тиждень збільшують освітлення до 2-5 тис. лк.
Склад середовища для культивування апікальних меристем винограду (мг/л): Макро МС - 100 мл μ-інозит – 75 мг
Мікро МС - 1 мл БАП – 2 мг
Вітаміни Уайта -1 мл Аденін – 80 мг
Fе-хелат - 5 мл Сахароза – 30 г.
Тема 13. Ознайомлення з індукцією кореневої системи при мікроклональному розмноженні винограду
План
1. Зміна складу живильного середовища
2. Індукція кореневої системи винограду
1. Зміна складу живильного середовища
Залежно від мети, яка поставлена для вирішення, змінюються температурний режим, освітлення, вологість тощо і, зокрема, склад живильного середовища.
Залежно від процесів метаболізму, які відбуваються в рослині, її органах індукують ся ростові речовини. Завдяки їх внесенню у штучне живильне середовище можна регулювати утворення тих або інших органів. Дуже важливою для нормального росту рослин є коренева система, а тому індукція кореневої системи в калюсній культурі чи в певних органів рослин великою мірою залежить від наявності ростових речовин.
2. Індукція кореневої системи винограду.
Добре вкорінюються пагони розміром 1,5-2 см з 3-6 листками. Перші корінці з'являються через 4-10 днів в залежності від сорту. При виконанні роботи використовувалися такі матеріали і обладнання: пробірки з конгломератом бруньок винограду, пробірки із стерильним поживним середовищем, пінцети, скальпелі, стерильні чашки Петрі, спиртівка.
Етапи виконання роботи
1.Для роботи використовують культуру апікальних меристем винограду через 3-4 тижні після початку культивування.
2.В ламінар-боксі виймають пробку із пробірки, обпалюють над спиртівкою горло пробірки і стерильним пінцетом виймають із пробірки конгломерат бруньок винограду та поміщають їх у стерильну чашку Петрі.
3. Розділяють за допомогою скальпеля конгломерат на окремі бруньки і кожну із них переносять за допомогою пінцету в пробірки з поживним середовищем для укорінення.
4. Пробірки з рослинним матеріалом поміщають в світлову термальну з освітленням 3-5 клк, фотоперіодом 14-16 год., температурою 20-25°С і вологістю 60%.
5. Через тиждень відмічають початок коренеутворення.
Склад поживного середовище для утворення кореневої системи при мікроклональному розмноженні винограду (мг/л)
Макро МС 25 мл
Мікро МС 0,25 мл
Вітамін РР 0,2 мл
Fе-хелат 5 мл
μ-Інозит 50 мг
ІОК 0,1 мг
Сахароза 10 г
Агар-агар 8 г
Тема 14. Одержання і культивування калюсу із стерильних проростків картоплі
План
1. Методи отримання калюсної тканини картоплі
2. Використання калюжної тканини картоплі для подальшого субкультивування
1. Методи отримання калюсної тканини картоплі
У відповідь на поранення паренхімні клітини, які перенесені на поживне середовище, що містить фітогормони, дедиференціюються, переходять до ділення і утворюють недиференційовану тканину — калюс. Калюс може бути одержаний із різних органів рослини, зокрема, у картоплі — із тканин стебла, листків, мікробульб, пиляків.
Залежно від умов культивування і походження калюсні тканини бувають рихлими, крихкими, компактними, середньої щільності з добре вираженими меристематичними осередками.
Для виконання роботи використовуються такі матеріали і обладнання:
ламінар-бокс, інструменти (пінцети, ланцети), чашки Пегрі, флакони з поживним середовищем, стерильні рослини картоплі в пробірці, спирт етиловий 96°, фарфорові склянки.
Етапи виконання роботи:
1. Пробірку із стерильною рослиною протирають спиртом, обпалюють над полум'ям спиртівки.
2. Пінцетом виймають стерильну рослину із пробірки і поміщають в стерильну чашку Петрі.
3. Підтримуючи рослину пінцетом, скальпелем розрізають її на експланти: стебло (довжиною 5-10 мм), листки. На експлантах роблять додаткові надрізи для появи в подальшому раневого калюсу.
4.Експланти поміщають у флакони з калюсогенним поживним середовищем.
Склад поживного середовища для культивування калюсної тканини картоплі
Макро МС | 100 мл/л |
Мікро МС | 1 мл/л |
Вітаміни МС | 1 мл/л |
Фолієва кислота | 0,5 мл/л |
Ре-хелат | 5 мл/л |
Мезоінозит | 200 мг/л |
Гідролізат казеїну | 1г/л |
Аденін | 1 мг/л |
Гліцин | 1 мг/л |
Кінетин | 0,2 мг |
2,4-Д | 3 мг/л |
Глюкоза | 20 г/л |
Сахароза | 20 г/л |
Агар-агар | 7 г/л |
рН 5,8
5. Флакони з рослинним матеріалом поміщають, у темнову культуральну кімнату при температурі 22-25°С і вологості 70%.
6. Через 14 днів проводять візуальне визначення частоти калюсо - утворення на експлантах.
2. Використання калюжної тканини картоплі для подальшого субкультивування.
Крива росту калюсної тканини носить S-подібний характер. Вона складається із початкової фази (лаг-фази), фази логаріфмічного росту, під час якої відбувається активне ділення клітин, фази сповільненого росту, стаціонарної фази і фази деградації. Для того, щоб зберегти здатність до ділення і подальшого росту, шматочок калюсної тканини переносять на свіже поживне середовище. Цей прийом підтримки клітинного ділення носить назву пасажування тканини. Пасажувати тканини можна необмежено багато раз. Але, при багаторазовому пасажуванні тканини на свіже поживне середовище спостерігається явище "звикання ", яке виражається в набутті автономності по відношенню до гормонів та втраті або значному послабленню здатності калюсних тканин до регенерації цілої рослини.
В процесі виконання роботи використовуватимуться такі матеріали і обладнання: культура калюсної тканини картоплі, моркви, флакони із стерильним поживним середовищем, стерильні пінцети, скальпелі, стерильні чашки Петрі.
Етапи виконання роботи
1. Перенесення первинного калюсу із флакону в стерильну чашку Петрі.
2.Відокремлення старої некротизованої ділянки та шматочки для садіння на агаризоване середовище.
3.Розділення калюсної тканини на рівні шматочки.
4.Шматочки калюсу асептично переносять у флакони із стерильним калюсогенним поживним середовищем. Шматочки необхідно дещо вдавити пінцетом в агар.
5.Флакони розміщують в термостат з температурою +25°С і вологістю повітря 60% на 3-4 тижні. Потім проводять зняття ростових характеристик утворених калюсних тканин.
Рекомендована література
1. Биотехнология растений: культура клеток /Под ред. .
Москва: Агропромиздат, 19с. (пер. с англ,).
2. , Сытник инженерия растений. - Киев: Наукова думка, 19с.
3. Завірюха П. Д. Сільськогосподарська біотехнолбгія: клітинна та генетична інженерія рослин. Короткий термінологічний словник. - Львів, 20с.
4. , , Полищук культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - Киев: Наукова думка, 1с.
5. Катаєва Н. В., Бутенко микроразмножение растений. - Москва: Наука, 19с.
6. , и др. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. - Москва: Агропромиздат, 1990: - 384 с.
7. , , Левенко біотехнології рослин. - Підручник. - Київ, 20с.
8. Рудишин біотехнології рослин. - Вінниця, 19с.
Додаткова
1. Агробиотехнология в мире. Научно-популярная монография. Под ред. . - Москва: Медиа», 20с.
2. Биотехнология в растениеводстве: Пер. с англ. - Новосибирск, 19с.
3.Биотехнология: введение в науку будущего / Автор-укладач . - Харків: Колорит, 20с.
4. Современные биотехнологии - вызов времени: - Киев: РА NOVA, 20с.
5. , Сытник инженерия растений. - К: Наукова думка, 19с.
6. , Сытник протопластов и генетическое конструирование растений. - К.: Наукова думка, 19с.
7. Глик Б, Пастернак Дж. Молекулярная биология. Принципи и применение.-М.: Мир, 20с.
8. Біотехнологія лікарських рослин: генетичні та фізіолого- біохімічні основи. К., 20с.
9. Кушнір Г. П., Мікроклональне розмноження рослин. - К.: Наукова думка, 20с.
10. Лугова высших растений. СПб., 20с.
11. Майщук розмноження картоплі in vitro: стан, проблеми, перспективи: Навчальний посібник. - Львів: Львівський державний аграрний університет, 19с.
12. Биотехнология: свершение и надежды: Пер. с англ.. - М: Мир, 1987.-411 с.
13. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник/ , Е. А Калашникова, и др.; Под ред.. - 2-е изд. перераб. и доп. - М: Высшая школа, 20с.
14. Пузік В. К., , /Атлас з біотехнології рослин: навчальний посібник - Харк. нац. аграр. ун-т ім. єва. - Харків, 20с.
14. А Биотехнология растений: клеточная селекция. - К.: Наукова думка, 19с.
ЗМІСТ
ВСТУП ……………………………………………………………….. 3
Правила з техніки безпеки під час роботи в біотехнологічній лабораторії ………………………………………………………..… 4
МОДУЛЬ 1. Біотехнологія як наука. Її роль у минулому і сучасному виробництві. Генна і генетична інженерія ………..….. 8
Тема 1. Порівняння визначення «біотехнологія», яке дають різні вчені …………………………………………………………………...8
Тема 2. Опрацювати методи стерилізації при проведенні робіт з біотехнології ……………………………………………………….... 9
Тема 3. Ознайомлення з оздоровленням с.-г. культур від шкідливих організмів з використанням біотехнологічних методів…………… 10
Тема 4. Визначення особливостей застосування живильного середовища для культури in vitro ……………………………………12
МОДУЛЬ 2. Біотехнологічні методи для подолання міжвидової несумісності та отримання гібридів ……………………………… .14
Тема 5. Виділення ізольованих зародків як метод отримання форм, стійких проти хвороб і шкідників …………………………………. 14
Тема 6. Виділення меристем картоплі і використання живильних середовищ для її культивування ……………………………..…… 16
Тема 7. Розмноження пробіркових рослин картоплі ………………19
Тема 8. Ознайомлення з отриманням міні - і мікробульб картоплі 21
МОДУЛЬ 3. Гаплоїдія в біотехнології. Клітинна інженерія …….. 23
Тема 9. Опрацювати основні підходи в приготуванні живильних середовищ для культивування ізольованих клітин і тканин суниці23
Тема 10. Ознайомитися з методиками вирощування стерильних проростків томатів і баклажанів …………………………………….25
Тема 11. Виділення апікальної меристеми суниці і культивування її ………………………………………………………………………….27
МОДУЛЬ 4. Мутагенез в біотехнології …………………………….30
Тема 12. Ознайомлення із методикою виділення і культивування апікальної меристеми винограду ……………………………………30
Тема 13. Ознайомлення з індукцією кореневої системи при мікроклональному розмноженні винограду ………………………..32
Тема 14. Одержання і культивування калюсу з стерильних проростків картоплі ………………………………………………….33
Рекомендована література ………………………………………… 37
Подгаєцький Анатолій Адамович
Біотехнологія в рослинництві
Редакційно-видавничий відділ Сумського національного аграрного університету, м. Суми, вул. Кірова, 160
_________________________________________________________________
Підписано до друку: ______ 2012 р. Формат А5: Гарнітура Times New Roman
Тираж: ______ примірників. Замовлення ____________ Ум. друк. дрк. ___
__________________________________________________________________
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
