Біотехнологія в рослинництві (стр. 1 )

МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ ТА ПРОДОВОЛЬСТВА УКРАЇНИ

СУМСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Кафедра біотехнології та фітофармакології

БІОТЕХНОЛОГІЯ В РОСЛИННИЦТВІ

Методичні рекомендації щодо проведення

лабораторно-практичних занять

Суми 2012

МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ ТА ПРОДОВОЛЬСТВА УКРАЇНИ

СУМСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Кафедра біотехнології та фітофармакології

БІОТЕХНОЛОГІЯ В РОСЛИННИЦТВІ

Методичні рекомендації щодо проведення

лабораторно-практичних занять

Для студентів денної і заочної форм навчання зі спеціальності

«Агрономія» і «Захист рослин»

Суми 2012

Рекомендовано до друку методичною радою

Протокол № від

УДК 557.21:575.22:581.6

Укладач: доктор с.-г. наук, професор єцький, зав. кафедрою біотехнології та фітофармакології

Методичні рекомендації складені для систематизації знань студентів при проведені лабораторно-практичних занять з «Біотехнології в рослинництві» денної форми навчання / Суми, СНАУ, 2012 р., 41 с.

Рецензенти: зав кафедрою захисту рослин СНАУ, доктор с.-г. наук

,

заступник директора з наукової роботи Інституту сільського господарства Північного Сходу НААН України, кандидат с.-г. наук

Відповідальний за випуск: Подгаєцький А. А., професор, зав. кафедрою біотехнології та фітофармакології

Рекомендовано до видання вченою радою навчально-наукового Інженерно-технологічного інституту СНАУ. Протокол № 9 від 22 травня 2012 року.

Сумський національний аграрний університет, 2012

ВСТУП

На думку американських учених, період з нинішнього часу до 2050 року вважається епохою бурхливого розвитку біологічних наук. Особливо це відноситься до відносно молодої і, водночас, давньої за спонтанним використанням – біотехнології.

Завдяки їй принципово по-новому стали розглядатися багато напрямів досліджень. Наприклад, завдяки біотехнології набуло практичного значення маніпулювання генами – трансгеноз, про що в недалекому минулому не можна було і мріяти. Принципово на нові рейки стала селекція на клітинному рівні. Заплановане оперування генами, клітинами дозволило виділити напрями дослідження генна і генетична інженерії та клітинна інженерії. Останнє слово, вважається, більш підходить до матеріалів неживої природи (конструювання станків тощо). Проте, бурхливий розвиток біотехнології дозволив проводити конструювання живих організмів на рівні генів, клітин.

Водночас, дослідження на організменному, клітинному, генному рівні надзвичайно складні як за виконанням, так із позиції теоретичних розробок. Вони вимагають ретельного дотримання численних специфічних методик, адже експерименти такого плану проводяться in vitro. Крім стерильності при їх виконанні необхідно особливо ретельно підходити до вибору середовища для культивування різних біологічних об’єктів. Причому, у окремих випадках, наприклад, при культивуванні ізольованих протопластів штучні живильні середовища, які використовуються, повинні бути надзвичайно близькими до тих, у яких знаходиться клітина в організмі.

Особливі можливості відкриваються для мутагенезу in vitro, поліплоїдії в ізольованих умовах, швидкому розмноженню цінних генотипів, збереженню колекційного матеріалу тощо.

У методичних рекомендаціях викладені основні підходи при виконанні лабораторно-практичних занять з біотехнології рослин. Вона рекомендована для студентів Агрономічного факультету СНАУ.

Правила техніки безпеки під час роботи в біотехнологічній лабораторії

Правила роботи з хімічними реактивами

1. Всі хімічні реактиви повинні зберігатися у спеціальній тарі, мати ярлики з чітким позначенням вмісту.

2. Забороняється зберігати у лабораторії хімічні сполуки невідомого походження, а також використовувати реактиви невідомого походження.

3. Скляні ємності з концентрованими розчинами повинні бути сухими і чистими ззовні і вміщені у корзини, які мають прокладки з тирси, змоченої негорючими матеріалами.

4. Під час роботи з кислотами і лугами, потрібно:

а) розливаючи кислоти, використовувати скляні трубопроводи із сифонами;

б) переливання "димлячих" кислот проводити тільки у витяжних шафах;

в) готуючи розчини кислот, кислоту вливати у воду при охолодженні, а не навпаки, тому що під час взаємодії кислоти з водою відбувається виділення великої кількості тепла, внаслідок чого суміш може розбризкуватися;

г) розчинення лугів проводити у глибоких фарфорових чашках з постійним перемішуванням і охолодженням у витяжній шафі;

д) всі роботи з великими об'ємами концентрованих розчинів лугів і кислот проводити тільки в гумових рукавичках, захисних окулярах, халатах;

е) розливати концентрований розчин аміаку тільки у протигазах;

є) якщо кислота або луг попали на стіл чи підлогу, розчин спочатку змити великою кількістю води, а потім нейтралізувати і знову промити.

5. Аптечка повинна містити: розчин йоду (5%), вату, валеріанові краплі, насичений розчин КМпО4, спирт, розчин NaНСОз (2%), розчин бури (2%), розчин оцтової кислоти (5%), розчин NH4 ОН (3%), розчин (NH4)2С03 (10%), кристали NaНСО3 чи СаС03, вапняну воду.

Основні правила роботи з електроприладами

1. Електронагрівальні прилади (до 800 Вт) вмикаються у звичайні розетки.

2. Електронагрівальні прилади (більше 800 Вт) під'єднуються до щитів і повинні мати контрольну лампочку.

3. Усі нагрівальні прилади повинні мати постійне місце, теплоізоляцію знизу і біля стін (кераміка). Над розетками повинні бути етикетки, які вказують напругу.

Забороняється:

а) працювати з електроприладами, які пошкоджені;

б) вмикати прилади біля летких речовин чи легкозаймистих рідин;

в) залишати електроприлади без нагляду;

г) працювати з електроприладами без заземлення;

д) користуватися "жучками".

1. Часто причинами пожеж є замикання, струмові перевантаження електрообладнання. Для попередження замикання потрібно передбачити електрозахист електроприладів: використання повітряних автоматичних вмикачів (автомати).

2. При експлуатації електропровідників не можна включати додаткові електроприлади, якщо провідники на це не розраховані. Не можна допускати перегрівання електроприладів.

Дії при виникненні пожежі

1. Діяти треба швидко, поки полум'я ще не охопило велику площу. Вимкнути електрику. Користуючись вогнегасником, необхідно скерувати отвір на предмет, що горить, а не на полум'я. Оповістити пожежну охорону, вказавши адресу. Із задимленого приміщення вибиратися треба, захистивши ніс і рот вологою тканиною. Не розкривати вікон і дверей. Не вистрибувати з вікон, якщо це не є єдиним шляхом до спасіння. Життя важливіше за обладнання.

2. Якщо одяг спалахнув, його треба скинути, або накрити місце, яке загорілося, тканиною (протипожежною ковдрою); Якщо тканина відсутня, треба впасти на землю і сильно притиснути частину, що спалахнула.

Типи вогнегасників та їх використання

1. Вуглекислотні вогнегасники ОУ-2, ОУ-5, ОУ-3 приводяться в дію поверненням маховичка вентиля до упору. Час роботи - 25-40 с.

2. 2. Вуглекислотно-брометилові вогнегасники ОУБ-3, ОУБ-7 можна використовувати для боротьби з пожежами електроприладів під напругою.

3. Хімічні вогнегасники ОХП-Ю (ОП-5) використовують, якщо загорілись тверді речовини і горючі рідини. їх не можна використовувати біля електроприладів! Час дії - 60 с.

Перша допомога потерпілим у разі виникнення небезпечних ситуацій

Ушкодження електрострумом

1. Вимкнути струм.

2. Якщо струм не можна вимкнути, прибрати електропровід сухою палкою або руками в гумових рукавичках. При цьому краще працювати однією рукою.

3. Викликати швидку медичну допомогу.

4. До появи медичного працівника:

а) якщо людина втратила свідомість, але дихає, її потрібно покласти і, розстебнувши одяг, збільшити доступ свіжого повітря; дати понюхати вату з нашатирем, розтерти і обігріти тіло;

б) якщо ознаки життя відсутні, потрібно робити штучне дихання і масаж серця.

При отруєннях

1. Отруєну людину винести на свіже повітря. Розстебнути одяг, але не переохолодити хворого.

2. Якщо дихання відсутнє - робити штучне дихання.

3. Якщо отрута попала в органи травлення - викликати блювоту, дати протиотруйні засоби.

При опіках

Хімічні опіки найчастіше виникають від дії концентрованих лугів і кислот.

При попаданні на шкіру:

видалити краплі рідини ватою, промити уражене місце великою кількістю

води, а потім нейтралізувати: кислоту - 2%-м розчином (NH4)2 СО3 чи

NаНС03; луг-2%-м розчином СНзСООН.

При опіках очей:

1. Промити очі великою кількістю води, потім 3%-м розчином NаНСОз.

2.Обов'язково звернутися за медичною допомогою.

При пораненнях

1. Якщо рана невелика, то спочатку промити розчином КМп04 (2%), а потім змазати розчином йоду і накласти пов'язку.

2. Якщо є велика кровотеча, то потрібно накласти джгут і звернутися в лікарню (джгут повинен бути накладений не більше як 1,5 год.).

Модуль 1. Біотехнологія як наука. Її роль у минулому і сучасному виробництві. Генна і генетична інженерія.

Тема 1. Порівняння визначення «біотехнологія», яке дають різні вчені.

План.

1. Ознайомлення з визначенням трактування «біотехнологія».

2. Проаналізувати тлумачення «біотехнологія» різними авторами.

3. Сформулювати власне поняття «біотехнологія».

1. Ознайомлення з визначенням трактування «біотехнологія».

Біотехнологія - це складне слово. Перша частина його „біо” в перекладі з грецького означає життя, живий організм. Друге – „техно” не що інше, як техніка. Але у словнику Даля на російську (українську) перекладається як заводське і ремісниче мистецтво, знання, уміння, а також способи робіт і прикладання їх до справи, вправність. Третє – „логос” – вчення. Дуже поширене у нас і інше слово – технологія, тобто процес, послідовність виконання операцій, пов’язаних із залученням техніки. Це дослівно. А тепер, що вкладають в це поняття виробничники, науковці.

2. Проаналізувати тлумачення «біотехнологія» різними авторами.

У словнику, який нещодавно вийшов, Глазко (батько і донька) дають таке трактування поняттю „біотехнологія” – це: 1) комплекс природних або штучно створених засобів для створення біологічних систем чи використання в промислових наукових цілях; 2) сукупність промислових методів, які використовують для виробництва живі організми і біологічні процеси. Двояке значення: для створення біологічних систем і для виробництва.

Визначення, яке наведено в підручнику «Генетика», автори: , івський, В. І.Князюк. Біотехнологія – це нова форма промислової технології, основою якої є біологічні об’єкти: тканини різних органів, соматичні клітини, що розмножуються in vitro, мікроорганізми, рослини і тварини.

У книзі «Біотехнологія» під редакцією академіка наведено таке трактування поняття: «Біотехнеологія – це наука про використання хіміко-біологічних процесів і біологічних об’єктів (мікроорганізмів, культур клітин і тканин рослинного і тваринного походження, ферментних препаратів та інших біологічно активних речовин) у промисловому виробництві».

3. Сформулювати власне поняття «біотехнологія».

Біотехнологія – це напрям біології, який вивчає можливість застосування біологічних об’єктів та процесів у наукових та практичних цілях.

Тема 2. Опрацювати методи стерилізації при проведенні робіт з біотехнології.

План.

1. Стерилізація приміщення, боксів (ламінар-боксу, мікробіологічного боксу).

2. Стерилізація живильного середовища, рослинного матеріалу.

1. Стерилізація приміщення, боксів (ламінар-боксу, мікробіологічного боксу).

Стериліація приміщення:

1. Підлогу кімнати миють водою з будь-яким миючим засобом.

2. Проводять стерилізацію кімнати ультрафіолетовим опромі­ненням, використовуючи лампи ПРК-7 (потужність 1000 Вт) або ПРК - 4 (потужність 500 Вт) на протязі 1,5-2 годин, в залежності від потужності ламп. Працювати в кімнаті можна через 2 години після виключення ламп.

Стерилізація ламінар-боксу: ламінар-бокси, як правило, обладнані УФ лампами, які можна залишати на ніч ввімкнутими для стерилізації внутрішньої поверхні. Крім того, перед роботою робочу поверхню ламінар-боксу протирають 96° етиловим спиртом.

Стерилізацію рук проводять з допомогою 96° етилового спирту, попередньо вимивши їх мильним розчином.

Стерилізацію інструментів: ножиці, ланцети, пінцети, голки прожарюють в сушильній шафі протягом 2-3 годин при температурі 160-180°С. Перед роботою інструменти стерилізують 96° спиртом і обпалюють над полум'ям спиртівки. Після цього їх поміщають на підставку для охолодження і використовують тільки для однієї маніпуляції. Перед повторним використанням інструментів, повторюють їх стерилізацію в полум'ї спиртівки.

Стерилізація посуду: весь посуд миють кислотним або лужним методом, промивають проточною водою, споліскують 2 рази дистильованою водою і один раз — бідистилятом. Після висихання посуд прожарюють в сушильній шафі при температурі 160-180°С протягом 2-2,5 годин. Посуд ще можна автоклавувати, попередньо загорнувши його в пергаментний папір. Стерильний посуд зберігають у закритих шафах, не допускаючи забруднення навіть слідами хімічних речовин.

У випадку, коли культуральні рослини, або клітини виявились інфікованими, то перед їх знищенням та наступним миттям посуду, їх автоклавують при тиску 2 атм протягом 50-60 хвилин.

2. Стерилізація живильного середовища, рослинного матеріалу.

Стериліація поживного середовища: тверді (агаризовані) і рідкі середовища автоклавують в пробірках, колбах або іншому скляному посуді. Час стерилізації залежить від об'єму середовища (табл. 1).

Складові поживних середовищ, які руйнуються чи коагулюють під час автоклавування (амінокислоти та їх аналоги, ферменти, мутагени) стерилізують механічним методом - через бактерицидні фільтри. Скляні фільтри після використання промивають концентро­ваною кислотою і кілька разів надлишком водопровідної і дистильованої води.

Стерилізація рослинного матеріалу: одержання стерильного

Таблиця 1. Режим автоклавування поживних середовищ

Об'єм середовища, мл	Час стерилізації (121 °С, 1 атм), хв
20-50	15
75	20
150-500	25
1000	30
2000	40

рослинного матеріалу — складне завдання, тому що необхідно нейтралізувати мікрофлору та не пошкодити рослинну тканину. Для цього використовують різні стерилізуючи речовини, які не прони­кають у тканину і легко змиваються водою.