Біотехнологія в рослинництві (стр. 3 )

Аналіз одержаних рослин на присутність вірусу F проводили з використанням індикаторного методу в чотириразовому повторенні. Встановлено, що калюсГлосарій.doc - Калус, який спочатку утворився мав вірус, але в кількості значно меншій, ніж вихідний матеріал (позитивна реакція виявлена лише при використанні індикаторного методу і лише на S. miniatum).

Калюс першого і наступних пасажів не мав вірусу. Таким чином, з використанням методу культури тканин вдалося отримати рослини вільні від вірусу F навіть при використанні інфікованого матеріалу.

Для багатьох культур встановлена доцільність використання не будь-яких тканин вірусних рослин, а апікальної (верхівкової) меристеми. Особливо підвищується ефективність одержання безвірусного матеріалу при використанні додаткових методів. Класичним прикладом в цьому відношенні може бути картопля.

2. Визначити оптимальний розмір меристеми умови підготовки матеріалу та склад живильного середовища для його культивування.

1. Важливим моментом для успішного виконання роботи є визначення розміру виділеної апікальної меристеми. Вважається, що мінімальний розмір її для отримання рослини складає 0,1 мм (100 мікронів). З іншої сторони, вільною від вірусів вважається меристема величиною 0,1-0,2мм. При використанні лише методу верхівкової меристеми найбільший вихід безвірусного матеріалу спостерігається при розмірі меристеми 0,125мм. У випадку поєднання цього методу з термотерапією величину меристеми можна збільшити до 0,250мм.

Отримання безвірусного насіннєвого матеріалу картоплі відбувається в декілька етапів. 1. Підготовка бульб для вичленення меристем. 2. Виділення меристем. 3. Вирощування виділених меристем. 4. Пересадка проростків. 5. Розчеренкування одержаних рослин та перший аналіз наявності вірусів. 6. Повторна дво-триразова перевірка ліній на зараженість вірусами. 7. Пересадка рослин з пробірок у теплицю. 8. Перевірка тепличних рослин на наявність вірусів. 9. Прискорене розмноження безвірусного матеріалу. 10. Випробування та розмноження тепличних меристемних клонів в польових умовах. 11.Збереження колекції оздоровлених сортів in vitroГлосарій.doc.

Для виділення меристеми відбирають бульби без симптомів грибних, бактеріальних хвороб та механічних пошкоджень. Як правило, вони беруться від клонів, які в процесі вегетації не мали симптомів вірусних хвороб та мали негативну реакцію при використанні ІФА.

Важливою є температура, при якій витримуються бульби для одержання паростків. В цілому, вважається, що максимальна затримка в поширенні вірусів у меристемі відбувається при 35-37 0 С і експозиції 3-4 тижні, залежно від біологічних особливостей сортів та вірусів. Ефективним виявилося також прогрівання частинок бульб при температурі 400 С 2-3 години на добу і витримуванням їх впродовж останнього часу при 18-20 0 С протягом 56 днів, хоча, в цілому, вважається, більш доцільним використання для отримання паростків цілих бульб. Ця робота проводиться в спеціальній термокамері, яка складається з двох боксів із стелажами. Вхід у другий бокс здійснюється через перший. Температуру підтримують автоматично, а вологість повітря на рівні 75% розміщення кювет з насиченим розчином кухонної солі. Бульби для термотерапії розміщуються у другому боксі в кюветах, наповнених піском. Останній зволожують двічі на день та один раз в десять днів підживлюють розчином Кнопа з мікроелементами за прописом Мурасіге-Скуга (5мл маточного розчину при 1х1000 на 1л розчину Кнопа). Це дозволяє уникнути фізіологічне почорніння та відмирання проростка і продовжити строки багаторазового зйому паростків до 4-6 місяців, незалежно від сорту.

У першому боксі підтримується температура 28-30 0 С. В ньому можна розміщувати бульби, які не пройшли періоду спокою. Їх розкладають також у кюветах з піском. Таким чином скорочується проходження періоду спокою у бульб перед закладанням їх на термотерапію. Це дозволяє розпочинати дослідження по оздоровленню сортів у серпні і мати паростки у вересні-жовтні. Крім цього, перший бокс є буфером для дотримання температурного режиму у другому. Окремі сорти особливо негативно реагують на термообробку бульб. Їх бульби погано проростають, дають поодинокі ростки. Для них рекомендовано проводити цю роботу в два етапи. На першому бульби витримують впродовж одного-двох тижнів при температурі 28-3- 0 С, а на другому біля чотирьох тижнів при 37-380 С.

Тема 7. Розмноження пробіркових рослин картоплі

План

1. Провести виділення меристем картоплі та визначитися з живильними середовищами для їх культивування.

2. Індукція органогенезу (стебел, коріння) у культурі калюжної тканини картоплі.

3. Отримання із калюжної тканини рослин-регенерантіів.

1. Провести виділення меристем картоплі та визначитися з живильними середовищами для їх культивування.

В останнє десятиріччя з метою одержання безвірусного вихідного матеріалу стали застосовувати термо - і хіміотерапію у поєднанні з культурою апікальних меристем. Ця робота досить складна, а тому проводять у спеціальних лабораторіях, в теплицях та в інших мовах на ізольованих ділянках. В Україні очолює цю роботу Інститут картоплярства УААН (селище Немішаєве Київської обл.).

Суть методу термотерапії в поєднанні з культурою меристеми полягає у регенерації рослин зі шматочків тканин при культивуванні в стерильних умовах на штучних середовищах in vitro.

Його використання грунтується на тому, що меристематична зона клітин, які діляться на верхівці паростка бульби, вільна або може бути вільна від вірусної інфекції при її культивуванні у штучних умовах на живильному середовищі, яке містить речовини, здатні пригнічувати розмноження вірусу (xіміотерапія).

З допомогою використання верхівкової меристеми сорт картоплі оздоровлюється один раз і такий матеріал як резерв для постійного оновлення можна підтримувати довгий час у пробірках. У Інституті картоплярства УААН виділення меристем та одержання рослин-регенерантів проводиться наступним чином. Паростки висотою 2-3 см : переносять у стерильний бокс для виділення меристем. Їх стерилізують у розчині діациду (йодинолу, гіпохлорату кальцію), а інструменти у сушильній шафі при температурі 125-150 0С, дистильовану воду - в автоклаві при тиску 1,1-1,5 атмосфери протягом години. Повторно інструменти стерилізуються у полум’ї спиртівки. Виділяють меристеми за допомогою загострених ін'єкційних медичних голок і переносять на поживне середовище.

2. Індукція органогенезу (стебел, коріння) в культурі калюжної тканини картоплі.

Особливість індукції органогенезу із калюжної тканини картоплі є висока ймовірність отримання мутантних рослин при застосуванні звичайних у таких випадках регуляторів росту. А тому, у живильні середовища, де культивується калюс з меристем не вводять біологічно активні речовини, зокрема β-ІОК. Кількість гібереліну збільшують до 1мг/л.

Повторна пересадка на свіжо виготовлене середовище здійснюється через 10-14 днів. При третій пересадці виключається гіберелін і вводиться β-ІОК у кількості 1мг/л.

3. Отримання із калюсної тканини рослин-регенерантів

Для забезпечення регенерації рослин у кімнатах чи камері, де розміщують меристеми, створюють оптимальні умови для отримання рослин: температуру 22-25 0С, освітлення 4-6 тис. люкс, відносну вологість повітря 75%. Регенерація рослин висотою 4-5 см з меристеми 150-250 мікронів проходить за 30-45днів.

Тема 8. Ознайомитися з отриманням міні - та мікробульб картоплі

План

1. Опрацювати методику розмноження пробіркових рослин

2. Отримання міні - та мікробульб картоплі

1. Опрацювати методику розмноження пробіркових рослин картоплі.

При розмноженні оздоровленого матеріалу картоплі живцюванням у пробірках (клональне мікророзмноження in vitro) використовують середовище, мінеральна основа якого модифікована з урахуванням біо­логічних особливостей картоплі.

Після відростання рослин із верхівок меристем до утворення 5-8 і листків їх у стерильному боксі пінцетом виймають з пробірки і на простерилізованій чашці Петрі гострим скальпелем або лезом безпеч­ної бритви розрізають на живці, включаючи частину стебла з одним листочком. На старому живильному середовищі можна зали­шити частину стебла з кореневою системою для повторного відрощу­вання. На 3-4 день після садіння у живців починається ріст стебла і коренів. Через 15-20 днів рослини повністю відростають і готові для повторного живцювання.

Слід підкреслити, що при живцюванні в рослинах-регенерантах здійснюється діагностика вірусної інфекції імуноферментним аналізом та методом електронної мікроскопії (при наявності електронного мікроскопа). Два нижніх живці беруть для приготування препаратів для аналізу, а решту висаджують з метою розмноження. Через 4 тижні вирощені рослини знову живцюють і проводять аналізи з діагностики вірусної інфекції вдруге.

Оздоровлена лінія включається в процес розмноження для нагромадження матеріалу - вихідного для первинного насінництва картоплі.

Розмноження вільних від вірусів рослин на штучних поживних середовищах у пробірках при використанні живцювання частин стебел дає змогу за кожні 15-20 днів у п'ять разів збільшити їх кількість. Такий спосіб розмноження дає змогу протягом 3-4 місяців одержати 2-3 тис. рослин, придатних для пересаджування в грунт.

2. Отримання міні - та мікробульб картоплі

У зв’язку із складнощами приживлення пробіркових рослин у польових умовах запропоновано перейти на масове використання мікробульб для використання їх при розмноженні оздоровленого матеріалу. ІІри цьому, вирощування міні бульб в умовах відкритого грунту ставить більш високі вимоги до їх якості. Розміри та біологічний склад мікробульб маю бути значно кращими, ніж для бульб, призначених для зберігання в колекції оздоровлених сортів. Для індукції мікробульб у пробіркових рослин in vitro використовують низку чинників: збагачене мінеральними елементами середовище, підвищений вміст (4-8%) цукру, скорочений фотоперіод на певному етапі росту рослин, біологічно активні речовини. Оптимальне співвідношення цих чинників дає можливість одержати повноцінні мікробульби діаметром 0,7-0,8 см на 80-85% висаджених живців. Такі мікробульби забезпечують одержання рослин, і формують у середньому 10-12 бульб загальною масою 580-680 г. Однак, слід підкреслити, що бульби ці в першому році суттєво відхиляються від типу сорту і, як правило, при загущеному садінні дають бульби менші стандартного розміру (мінібульби).

Модуль 3. Гаплоїдія в біотехнології. Клітинна інженерія

Тема 9. Опрацювати основні підходи у приготуванні живильних середовищ для культивування ізольованих клітин і тканин суниці

План

1. Приготувати маточні розчини мікро - і макросолей, вітамінів, регуляторів росту

2. Визначитися з їх необхідністю їх використання для культивування ізольованих клітин і тканин плодових.

1. Приготувати маточні розчини мікро - і макросолей, вітамінів, регуляторів росту.

Мінеральні компоненти середовища приготовляють з реактивів високої хімічної чистоти з перевіреним терміном придатності.

Для зручності в роботі макроелементи приготовляють у виді маточних розчинів з концентрацією у десять разу більшою, ніж необхідно для приготовлення середовищ і зберігають у холодильнику при температурі біля 40С впродовж двох місяців. Розчини мікроелементів приготовляють з концентрацією у 100 разу більшою, порівняно з необхідною для живильних середовищ. Усі компоненти готують з використанням бідистильованої води.

Маточні розчини гормональних речовин і вітамінів приготовляють відповідно їх властивостей стосовно розчинення і в концентраціях, зручних для роботи. 2,4-дихлофеноцтову кислоту, α – нафтилоцтову кислоту приготовляють, розчиняючи в невеликій частині етанола, а цитокініни – в 0,5N HCl (на водяній бані), а потім добавляють необхідну кількість води. Розчини таких речовин, як гідролізат казеїна, дріжджовий екстракт, β – індолілоцтову кислоту приготовляють безпосередньо перед закладання досліду.

Слід строго дотримуватися порядку додавання складових у середовище. Гормони і вітаміни додають останніми.

2. Визначитися з їх необхідністю їх використання для культивування ізольованих клітин і тканин суниці.

При культивуванні апікальних меристем суниці на поживному середовищі з високим вмістом кінетику під дією цього гормону відбувається пригнічення апікального домінування верхівкової меристеми і активація пазушних меристем. Для виконання роботи необхідні наступні матеріали і обладнання: столони суниці, пробірки з поживним середовищем, стерильні чашки Петрі, скальпелі, стерильна голка.

Виділяють такі етапи при культивуванні суниці in vitro. 1. Промивають столони суниці в мильному розчині і ополоскують водопровідною і дистильованою водою.

3. Виділяють скальпелем пазушні бруньки, які знаходяться у основи листків столонів полуниці. Всю подальшу роботу необхідно проводити в ламінар-боксі.

4. Бруньки занурюють для стерилізації в 0,1%-ний розчин сулеми на 6-10 хв.

5. Простерилізовані бруньки 5-6 раз промивають в стерильній дистильованій воді.

6. Бруньки переносять в чашку Петрі і використовують для вичленення меристем.

7. Бруньку переносять на предметне скло і розглядають під мікроскопом при дев'ятикратному збільшенні.

8. Звільняють бруньку за допомогою препарувальної голки і скальпеля від багаточисельних листкових лусок, після чого підтримуючи її голкою, скальпелем вичленяють меристема - тичний купол з 1-2 листковими примордіями.

9. Меристематиний купол переносять в пробірку з поживним середовищем.

10. Пробірки поміщають в світлову кліматичну камеру при температурі 25°С.

11. Одержані через 2 тижні пазушні бруньки суниці виймають в ламінар-боксі із пробірки і поміщають в чашку Петрі.

12. Одержані бруньки відокремлюють одну від одної і висаджують на свіже поживне середовище.

13.Культивують при температурі 25°С, освітленні 2-3 клк, 16- годинному фотоперіоді, відносній вологості повітря 70-75%.

Склад середовища для культивування апікальних меристем суниці (мг/л)

Макро МС	100 мл
Мікро МС	1 мл
Вітаміни Уайта	1 мл
Ре-хелат	5 мл
БАП	0,5 мг
Аскорбінова кислота	1 мг
Сахароза	20 г
Агар-агар	7 г

рН 5,8

Тема 10. Ознайомитись з методиками вирощування стерильних проростків томатів і баклажанів

План

1. Отримання стерильних проростків для подальшої диференціації та отримання калюжної тканини.

2. Опрацювати два шляхи використання стерильних проростків томатів і баклажанів.

1. Отримання стерильних проростків для подальшої диференціації та отримання калюжної тканини.

Стерильні проростки вирощують з метою одержання екс­плантів для введення в калюсну культуру. Існує два можливих шляхи використання стерильних проростків: 1) для одержання експлантів із диференційованих тканин, які при перенесенні на поживне сере­довище, що містить фітогормони, дедиференціюються і в резуль­таті інтенсивної проліферації утворюють калюсну тканину; 2) для одержання первинного калюсу безпосередньо на проростках, який може бути ізольований і перенесений в стерильних умовах на поживне середовище, що містить фітогормони, з метою подальшого культивування.

В роботі використовують такі матеріали і обладнання: бокс для стерильних робіт з ламінарним потоком повітря, пінцети, розчин стерилізатору ("Білизна"), насіння, стерильні: фільтрувальний папір, дистильована вода, лабораторний посуд (чашки Петрі, стакани хімічні), поживні середовища, 70% розчин етанолу.

2. Опрацювати два шляхи використання стерильних проростків томатів і баклажанів.

Виділяють наступні етапи виконання роботи:

1. Готують розчин стерилізатора: 1 частина "Білизни" і 2 частини

стерильної дистильованої води.

2. Відбирають здорові, однакові насінини, ретельно промивають їх в мильному розчині, поті л ополіскують водопровідною водою і дистильованою подою. Насіння поміщають в марлевий мішок.

3. Роботу проводять в ламінар-боксі. Насіння занурюють в 70% розчин етанолу. Потім у склянку із стерилізатором ("Білизна") занурюють насіння і залишають на 15-20 хвилин. Насіння тричі по 10 хвилин промивають стерильною дистильованою водою, обсушують на фільтрувальному папері і розміщують в чашки Петрі на поживне середовище.

Склад поживного середовища для пророщування проростків (мг/л):

Макросолі по МС	50 мл
Мікросолі по МС	0,5 мл
Fе-хепат	5 мл
Вітаміни по МС	0,5мл
Сахароза	20 г
Агар-агар	7-8 г

pH=5,6-5,8

4. Чашки Петрі закривають парафіном і ставлять до термостату для пророщування насіння та отримання стерильних проростків (температура +23-25°С, абсолютна темрява). Через 3-4 доби перевіряють чистоту посіву.