Основы техники бактериологических исследований (стр. 10 )

В значительно меньшем количестве в толстой кишке об­наруживается транзиторная микрофлора: протей (Proteus), клебсиеллы (Klebsiella), а также клостридии (CI. perfringens, О. sporogenes), синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa), дрожжеподобные грибы (Candida albicans), простейшие (Enta­moeba gingivalis).

Микрофлора мочеполовой системы

Почки, мочеточники, моча в мочевом пузыре в норме сте­рильны. В наружной части уретры встречаются пептококки (Peptococcus), пептострептококки (Peptostreptococcus), коринебактерии (Corynebacterium), бактероиды, микобактерии (Mycobacterium), а также грамотрицательные бактерии фе­кального происхождения.

На наружных половых органах мужчин и женщин локали­зуются микобактерии смегмы (Mycobact. smegmatis), имеющие морфологическое сходство с микобактериями туберкулеза.

Микрофлора влагалища закономерно изменяется на раз­ных этапах полового созревания. В течение первых 4 недель после рождения преобладают лактобактерии (Lactobacillus aci­dophilus), в то же время во влагалище можно обнаружить ста­филококк (Staph. saprophyticus), стрептококк (Streptococcus faecalis), коринебактерии (Corynebacterium xerosis).

С наступлением половой зрелости появляются молочно­кислые бактерии Додерлейна (крупные, Гр+палочки).

На шейке матки обнаруживаются бактерии, проникающие туда из влагалища. Полость матки у здоровых женщин сте­рильна.

Палочка Додерлейна слизистой влагалища является анта­гонистом гноеродных микробов. В зависимости от количест­венного соотношения палочек Додерлейна и кокковой флоры определяется степень чистоты влагалища.

I степень чистоты	палочки Додерлейна
П степень чистоты	палочки Додерлейна + кокки единичные (1-5 в поле зрения)
Ш степень чистоты	палочки Додерлейна единичные + кокки (более 50%)

Значение нормальной микрофлоры

Положительная роль нормальной микрофлоры для орга­низма человека связана с витаминообразующим, фермента­тивным, антагонистическим, иммунизирующим и другими ее свойствами.

1. Некоторые энтеробактерии (Е. coli) синтезируют вита­мины группы В, витамин К, пантотеновую и фолиевую кис­лоты.

2.  Постоянный обитатель кишечника человека Е. coli, об­ладает свойствами вырабатывать пищеварительные ферменты.

3.  Облигатная микрофлора (молочнокислые бактерии, актиномицеты, кишечная палочка и др.) обладает выраженны­ми антагонистическими свойствами в отношении многих воз­будителей инфекционных заболеваний. Это связано с образо­ванием антибиотических веществ, бактериоцинов, спиртов, молочной кислоты, жирных кислот, перекиси водорода и дру­гих продуктов, ингибирующих размножение патогенных видов.

4.  Важную роль играет микрофлора в формировании ре­зистентности организма.

5. Некоторые представители нормальной микрофлоры
толстого кишечника участвуют в обмене жирных кислот.

6. Микроорганизмы - обитатели толстой кишки оказыва­ют благоприятное воздействие на структуру слизистой оболоч­ки кишечника и ее адсорбционную способность.

Понятие «дисбактериоз». Условия развития

Дисбактериоз - качественное и количественное наруше­ние экологического баланса между микробными популяциями в составе микрофлоры организма человека. Дисбактериоз воз­никает при нерациональном использовании антибиотиков широкого спектра действия (тетрациклины, левомицетин и др.), при резком снижении резистентности организма вслед­ствие хронических инфекций, радиации, пребывании людей в экстремальных условиях.

При дисбактериозах происходит подавление микробов-ан­тагонистов, регулирующих состав микробного биоценоза и размножение условно-патогенных микробов. Таким путем происходит нарастание и распространение микроорганизмов из родов Proteus, Pseudomonas, Klebsiella, являющихся причи­ной внутрибольничных инфекций, дрожжеподобных грибов Candida albicans, вызывающих кандидозы. Е. coli, являющихся возбудителем колиэнтеритов, особенно у детей и других за­болеваний.

Вопросы для обсуждения

1. Понятие «биоценоз». Понятие «факультативные и облигатные микро­организмы».

2. Микрофлора кожи и слизистых оболочек.

3. Микрофлора дыхательных путей.

4. Микрофлора полости рта.

5. Микрофлора желудочно-кишечного тракта.

6. Микрофлора мочеполовой системы.

7. Значение нормальной микрофлоры.

8. Понятие «дисбактериоз». Условия его развития.

Самостоятельная работа студентов проводится в 2 этапа: на одном заня­тии производится посев материала, на втором - изучение выросших микро­организмов.

МИКРОФЛОРА КОЖИ

Посев волоса и «отпечатков» с губ и пальцев рук на МПА

Методика. На чашки Петри со стерильной средой МПА, разделенной на 3 сектора (губы, пальцы, волосы), делаются отпечатки с пальцев рук, осторожно касаясь среды. На сле­дующий ректор укладывали 2-3 волоса, взятых стерильным пинцетом, плотно прижимая их к агару.

При посеве отпечатков с губ коснуться губами третьего сектора на МПА. Посев инкубируется в термостате 24 часа при температуре 37 °С.

МИКРОФЛОРА НОСА И ЗЕВА

Посев отделяемого из носа на кровяной агар

Методика. Чашку с кровяным МПА делят на 2 части. Слизь из носа 6epут стерильным тампоном и засевают ее на половину чашки. Для этого тампоном проводят полосу, параллельную линии раздела. При посеве тампон нужно вращать, чтобы он со всех сторон коснулся агара, посев распределяется простерилизованной петлей по всей поверхности соответствующей половины чашки Петри штрихами, перпендикулярно пересекающими линию, нанесенную тампо­ном.

Во вторую половину чашки Петри точно так же делается посев отделяемого из зева, взятого другим тампоном.

МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА

Посев кала на среду Эндо

Методика. Для определения микрофлоры кишечника де­лается посев испражнений на среду Эндо. Стерильной петлей берется капля испражнений и методом штриха на чашку Петри делается посев. Инкубация в термостате при темпера­туре 37 оС и времени 24 часа.

МИКЛОФЛОРА ЗУБНОГО НАЛЕТА

Методика. Для приготовления мазка материал берут с зуб­ной бляшки (стерильным шпателем) палочкой, делают мазок на предметном стекле с физраствором, высушивают, фикси­руют и окрашивают по Граму, микроскопируют.

Обнаруженные в препарате микробы сравнивают по мор­фологии с микроорганизмами, нарисованными на таблице «Зубной налет», рисуют и обозначают. Рисунок оформить над­писью «Микроорганизмы из зубного налета, окраска по Граму».

Оформление протокола

Выписать основных представителей нормальной микро­флоры по латыни, нарисовать микропрепарат из зубного на­лета.

Тема: «Генетика бактерий»

Цель:

– ознакомить с особенностями генетического аппарата бактерий,

механизмами рекомбинации, ролью генной инженерии в

современной медицине и биотехнологии.

Знать:

– механизмы изменчивости бактерий, виды рекомбина­ций;

– значение конъюгативных плазмид в распростра­нении

антибиотикорезистентности и биологии бакте­рий.

Уметь:

– отличить модификационную изменчивость от мутаци­онной;

– оценить бактериоциногенность культур;

– дока­зать плазмидную природу антибиотикорезистент­ности.

Генетический аппарат бактерий имеет ряд особенностей ор­ганизации.

Особенности генетического аппарата бактерий:

1) цитологические:

-  наследственный аппарат бактерий представлен нуклеоидом;

-  в отличие от ядра нуклеоид не имеет ядерной мембраны;

-  в нуклеоиде нет ядрышек;

-  в нуклеоиде одна хромосома;

-  в бактериальной клетке может быть дополнительное на­следственное вещество – плазмида;

-  молекула ДНК хромосомы и плазмиды прикрепляются к ЦПМ.

2) молекулярные:

-  хромосома бактерий имеет кольцевую структуру;

-  хромосома бактерий — чистая двунитчатая ДНК, не со­держит гистонов;

-  в ДНК бактерий повышенное содержание метиллированных (минорных) азотистых оснований, они выполняют защит­ную функцию гистонов;

-  ДНК бактерий содержит Is-последовательности, строение которых аналогично таким же участкам ДНК у высших орга­низмов;

-  отмечается выраженная изменчивость нуклеотидного со­става: соотношение гуанина и цитозина (Г/Ц-индекс) у бактерий имеет видовые отличия.

Важное место в генетике бактерий занимают плазмиды – дополнительные, внехромосомные элементы наследственности. Плазмида, как и хромосома, представлена кольцевой молекулой двунитчатой ДНК, но ее размеры значительно меньше хромосо­мы. Плазмида содержит структурные гены, кодирующие тот или иной признак, гены автономной репликации, Is-последователь­ности. У некоторых плазмид есть гены, ответственные за ее трансмиссивность (перенос, передачу). Такие плазмиды назы­ваются трансмиссивными (конъюгативными).

Основные свойства плазмид:

1.  гены плазмид несут не обязательную для клетки инфор­мацию, а лишь сообщают ей селективные преимущества; без плазмид клетка существовать может, а без хромосомы нет;

2.  плазмидная ДНК имеет значительно меньшую молеку­лярную массу, чем хромосомная;

3.  плазмиды способны к автономной репликации, или их репликация находится под ослабленным контролем хромосомы;

4.  для плазмид с низкой молекулярной массой характерно явление амплификации (многокопийности);

5.  некоторые плазмиды (F-, R-факторы) способны нахо­диться как в автономном, так и интегрированном с хромосомой состоянии; штаммы, у которых F-фактор интегрирован с хромо­сомой, – Hfr-штаммы;

6.  молекула ДНК плазмид более подвержена воздействию физических и химических агентов, чем хромосомы; частота плазмидных мутаций выше, чем хромосомных;

7.  некоторые физические (УФ, СВЧ и др.) и химические (акридиловые красители) агенты вызывают элиминацию (удаление, потерю) плазмид;

8.  плазмиды могут содержать tra-гены и самостоятельно пе­редаваться в процессе конъюгации, это конъюгативные плазми­ды; частота передачи плазмидных генов выше, чем хромо­сомных; трансмиссивность (передача, перенос) плазмид может быть связана и с переносом их в клетки умеренными трансдуцирующими фагами;

9.  в клетке могут находиться несколько разных плазмид, но некоторые плазмиды несовместимы между собой; по этому приз­наку различают группы несовместимости плазмид.

Плазмиды могут детерминировать разные свойства бакте­рий.

Различают:

1.  R-плазмиды – кодируют лекарственную устойчивость.

2.  F-плазмида – определяет пол бактерий.

3.  Col-плазмиды – детерминируют синтез бактериоцинов.

4.  Hly-плазмиды – кодируют синтез гемолизинов.

5.  Ent-плазмида – детерминирует синтез энтеротоксина.

6.  Плазмиды биодеградации – обусловливают расщепление сложных ароматических и других соединений, например, нефти, парафина, ПАВ и др.

Плазмиды играют важную роль в процессах рекомбинации (обмена генетической информацией) у бактерий.

У бактерий, как и у всех живых организмов, есть 2 типа из­менчивости: фенотипическая и генотипическая. Фенотипическая изменчивость – это изменение только каких-либо внешних признаков, она не затрагивает генотип. Генотипическая измен­чивость затрагивает не только фенотип, но и генотип. Она связа­на с изменениями генетического аппарата.

Проявлениями фенотипической изменчивости у бактерий являются модификации: кратковременные (в пределах одного поколения) и длительные (сохраняются в поколениях).

Отличия длительной модификации от мутации:

1.  отсутствие изменений в структурных генах генотипа;

2.  приобретение новых свойств большим числом особей в популяции;

3.  «затухание» (исчезновение) признака в ряду поколений.

Примером фенотипической изменчивости бактерий являет­ся диссоциация – расщепление признака – при изменении усло­вий культивирования: переход S-форм с гладкими колониями в R-формы с шероховатыми колониями, потеря пигмента, появле­ние неподвижных вариантов у подвижных бактерий и т. д.

Генотипическая изменчивость бактерий связана с мутациями и рекомбинациями.

Мутации у бактерий могут быть спонтанные и индуциро­ванные известным мутагеном. По локализации различают:

1.  генные – затрагивают один ген;

2.  хромосомные – затрагивают группу генов;

3.  плазмидные – затрагивают гены плазмид.

Механизм мутаций Вам известен. Это: а) деления – потеря гена или участка ДНК; б) дупликация – удвоение генетического фрагмента; в) транспозиция – изменение положения гена; г) инверсия – переворот участка ДНК на 180°; д) вставка нового гена.

Фенотипическое проявление мутаций чаще ведет к потере признака – прямая мутация или к его восстановлению – обрат­ная мутация. Так как у бактерий одна хромосома, то частота фенотипических проявлений мутаций высока, а делеция большого участка хромосомы летальна для бактерий.

Вторым механизмом генотипической изменчивости у бакте­рий являются рекомбинации.

Особенности рекомбинаций у бактерий:

1.  однонаправленность переноса генетической информации (от донора к реципиенту);

2.  неодинаковое долевое участие генома донора и реципи­ента в образовании рекомбинанта (реципиентный геном полнос­тью переходит к рекомбинанту, а от донора – только отдельные гены, плазмиды);

3.  в результате рекомбинации образуется мерозигота (частичная зигота);

4.  наличие нескольких механизмов рекомбинаций: конъ­югация, трансформация, трансдукция, слияние протопластов.

Механизмы рекомбинаций

I.  Конъюгация – перенос генетической информации при непосредственном контакте донора и реципиента. Это аналог полового процесса у бактерий. Пол у бактерий определяет F-плазмида: в «мужских» клетках (F+) она есть, в «женских» (F-) — отсутствует.

Отличия F+ и F- клеток:

-  у F+ клеток есть дополнительная генетическая информа­ция (F-фактор);

-  F+ клетки имеют на поверхности специальные f-пили, обеспечивающие контакт клеток при конъюгации;

-  F+, клетки имеют дополнительный fi-антиген (белок f-пилей);

-  F+ и F - клетки отличаются поверхностным зарядом;

-  F+ клетки чувствительны к «мужским» фагам, которые не адсорбируются на F - клетках;

-  F+ клетки обладают свойствами донора (отдают генетическую информацию), a F - клетки – свойствами реципиента (воспринимают генетическую информацию). Как уже указывалось, реципиентные клетки участвуют в образовании рекомбинанта реем своим геномом, а донор передает свою генетическую инфор­мацию лишь частично. Чаще это конъюгативные плазмиды, но Hfr-штаммы передают с высокой частотой хромосомные гены при конъюгации.

II.  Трансдукция – перенос генетической информации от до­нора к реципиенту с помощью трансдуцирующего фага. Трансдуцирующий фаг – это умеренный фаг, который при индукции лизогенной культуры захватывает соседние бактериальные гены и при инфицировании новых клеток вносит в них эти гены. При строгой специфичности локуса интеграции умеренного фага с хромосомой лизогенной клетки (например, для фага α, – рядом с 1ас-опероном, для фага Р – рядом с trp-опероном и т. д.) при индукции захваты­ваются и переносятся всегда строго определенные гены – это спе­цифическая трансдукция. Перенос случайных бактериальных генов умеренным фагом – общая трансдукция. Захват случайных бакте­риальных генов может происходить при сборке фагов или в том случае, когда профаг не имеет строго определенного локуса в геноме бактерий.

Как Вы знаете, изменение свойств бактерий, инфицирован­ных умеренным фагом, может происходить и под действием ге­нов самого фага –явление фаговой, или лизогенной конверсии.

Отличия трансдукции от фаговой конверсии:

- приобретение новых свойств при трансдукции идет за счет бактериальных генов, а при фаговой конверсии – за счет фагов;

- частота трансдукции значительно ниже частоты фаговой конверсии.

III.  Трансформация – передача генетической информации при культивировании реципиента на среде с ДНК донора.

Трансформация возможна у близкородственных бактерий. Реципиент получает не всю молекулу ДНК донора, а ее отдель­ные фрагменты. Реципиентные клетки должны быть в состоянии компетентности. У клетки, готовой воспринять генетическую ин­формацию, обнаруживается особый белок – фактор компетент­ности. Его действие связывают:

-  с повышением проницаемости клеточной стенки и ЦПМ для ДНК;

-  с ингибированием ДНК-аз;

-  с активированием синтетаз и рестриктаз.

Это состояние наблюдается в процессе деления клетки. Ког­да она активно строит свою ДНК, то в этот момент могут быть захвачены фрагменты чужой ДНК. In vivo в популяции часть клеток всегда активно размножается, а часть погибает, то есть имеются условия для трансформации. In vitro эти условия созда­ют искусственно.

Самостоятельная работа студентов

на практическом занятии

1.  Опыт «Конъюгация 1»: передача хромосомного признака фер­ментации лактозы (Lac+) y E. сoli.

Донор: E. Coli Hfr C Lac+ Sms

Реципиент: E. Coli K 12 F- Lac- Smr

Рекомбинант: ? (назовите его и укажите генетическую ха­рактеристику по указанным маркерам).

Условные обозначения: – Sm - стрептомицин; S - чувстви­тельный; г - хромосомный признак резистентности к антибио­тику.

К 5 мл суточной бульонной культуры реципиента добавьте 0,5 мл суточной бульонной культуры донора (густота 5х108 м. т./мл). Смесь поместите в термостат на 30-60 минут, после чего сделай­те высев 0,1 мл на селективную среду Эндо со стрептомицином.

Контроли:

1) посев донора и реципиента на среду Эндо;

2) посев донора и реципиента на среду Эндо со стрептомицином. Через 18-24 часа просмотреть посевы.

Контроли:

1) на среде Эндо донор дает окрашенные в крас­ный цвет колонии за счет расщепления лактозы среды Эндо (меняется рН, меняется цвет индикатора), реципиент дает бес­цветные колонии, так как не расщепляет лактозы;

2) на среде Эндо со стрептомицином донор не растет, так как погибает под действием антибиотика, а реципи­ент, устойчивый к действию антибиотика, растет и дает бесцвет­ные колонии.

В опыте из конъюгационной смеси на среде Эндо со стрептомицином вырастают колонии реципиента и рекомбинанта.

Как их отличить?

Подсчитайте число колоний рекомбинанта и рассчитайте частоту передачи признака ферментации лактозы по формуле:

где: К - частота передачи признака;

n - число колоний рекомбинанта;

d - число клеток донора в конъюгационной смеси.

Зарисуйте схему опыта. Учтите результаты.

2.  Опыт «Конъюгация 2»: передача плазмидного признака рези-стентности к тетрациклину (R Тc).

Донор: E. сoli M 17 Lac+ Sms (R Тc).

Реципиент: S. flexneri - Lac- Smr Tcs

Рекомбинант: ? (назовите его и укажите генетическую ха­рактеристику по указанным маркерам).

К 5 мл суточной бульонной культуры реципиента добавьте 0,5 мл суточной бульонной культуры донора (густота 5х108 м. т./мл). Смесь поместите в термостат на 30-40 минут, после чего сделай­те высев 0,1 мл на селективную среду Эндо со стрептомицином и тетрациклином.

Контроли:

1) посев донора и реципиента на среду Эндо со стрептомицином;

2) посев донора и реципиента на среду Эндо с тетрациклином;

3) посев донора и реципиента на среду Эндо со стрептомицином и тетрациклином.

Произведите учет результатов через 18-24 часа. Зарисуйте результаты эксперимента. Чьи колонии выросли из конъюгационной смеси на среде Эндо+Тс+Sm? Рассчитайте частоту переда­чи признака тетрациклино- резистентности по выше приведенной формуле (см. задание к опыту № 1).

3.  Опыт по трансдукции: передача триптофанового признака (tгр+) у сальмонелл трансдуцирующим фагом Р 22.

Донор; S. typhimurium trp+ (лизогенный штамм по фагу Р 22)

Реципиент: S. typhimurium trp-