Основы техники бактериологических исследований (стр. 3 )

К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый генциановым фиолетовым и йодом, удерживается при обработке их спиртом. Такие бактерии называются грамположительными.

К другой группе относятся бактерии, не обладающие свойством удерживать комплекс и обесцвечивающиеся при обработке спиртом. Их называют грамотрицательными. Способность или неспособность клеток удерживать комплекс генцианового фио­летового с йодом связывают с различным составом и структурой клеточной стенки бактерий.

Самостоятельная работа студента

на практическом занятии

Последовательность действий (этапы)	Способы действия (ориентиры)
I. Ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории	Прочитать и продумать «Правила работы студентов, работающих на кафедре микробиологии».
II. Приготовить и окрасить препараты из бактериальных культур	1.  Внимательно проследите за демон­страцией преподавателем техники приготовления и окраски препаратов; приготовьте мазки-препараты из куль­тур стафилококков и кишечной палоч­ки. 2.  Окрасьте приготовленные мазки про­стым способом – водным фуксином и метиленовой синью; ознакомьтесь с наиболее употребительными краска­ми, применяемыми в микробиологической практике.
III. Микроскопировать и зарисовать окрашен-­ ные мазки-препараты различ­ных форм бактерий	1.  Прочитайте «Правила употребления иммерсионной системы»; внимательно проследите за демонстрацией препо­давателем техники микроскопии пре­паратов с помощью иммерсионной си­стемы; самостоятельно промикроскопируйте один из препаратов, проверяя каждый из этапов работы. 2.  Промикроскопируйте и зарисуйте мазки-препараты различных форм бактерий: круглые (стафилококк, сарцина, стрептококк), извитые (вибрион, спирилла).
IV. Сдать преподава­телю выполненную работу	Дайте на просмотр преподавателю пре­параты и тетрадь, приведите в порядок рабочее место и сдайте его дежурному студенту.

Тема: «Строение бактериальной клетки. Сложные методы окраски. Обнаружение капсулы и оболочки, спор у бактерий»

Цель:

– научиться различать отдельные структурные элементы

бактерий с использованием сложных методов окраски.

Задачи:

– овладеть навыками сложных методов окраски;

– уметь обнаруживать структурные элементы бактерий при

микроскопировании.

Ультраструктура бактерий изучается с помощью электрон­но-микроскопических и микрохимических исследований. К обя­зательным структурным элементам бактерий относится оболоч­ка, цитоплазма, ядерное вещество (нуклеоид), к необязатель­ным – споры, жгутики, капсула, различные включения.

У грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый слой, у грамотрицательных – липополисахаридный. Под влиянием некоторых факторов (лизоцим, антибиотики, УФЛ и др.) происходит растворение клеточной стенки: частичное (сферопласты) или полное (протопласты). Клеточная стенка определяет форму клетки и обладает прочностью, ригидностью, регулирует осмотическое давление и аэрацию, выполняет трофи­ческую функцию. Цитоплазматическая мембрана прилегает к внутренней поверхности стенки клетки и состоит из трех слоев: липидного, протеинового и полисахаридного. Цитоплазматиче­ская мембрана выполняет функцию разделительной перегородки.

Нуклеоид содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту, локализован в центральной части клетки.

Для обнаружения нуклеоида используют микрохимическую реакцию Фельгена с применением слабокислотного гидролиза. При этом освобождающаяся дезоксирибоза переходит в альдегиды, вступающие в реакцию с бесцветной фуксинсернистой кислотой специального реактива Шиффа. При этом нуклеоид окрашивается в красно-фиолетовый цвет.

Ядерную субстанцию можно выявить при электронно-микроскопических исследованиях ультратонких срезов бактерий.

Обнаруживаются споры при окраске по методу Циля-Нильсена.

Методика окраски по Граму

На мазок кладут фильтровальную бумагу и наливают кар­боловый раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты. Снимают бумагу и, не промывая мазок водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту, обесцвечивая препарат в 96%-ном спирте в течение 30 секунд. Промывают водой. Красят 1-2 минуты вод­ным раствором фуксина. Ополаскивают водой и высушивают. В ре­зультате окраски грамположительные микробы окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный.

Техника окраски:

1.  Фиксированный мазок покрывают полоской бумаги, на нее наносят карболовый фуксин Циля и несколько раз подогре­вают над пламенем горелки до появления паров, каждый раз подливая краситель.

2.  Бумагу снимают и обесцвечивают мазок в 5%-ном рас­творе серной кислоты, затем промывают водой.

3.  На мазок наливают раствор метиленового синего на 3-5 минут.

4.  Препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют с иммерсионной системой.

Методика окраски по Нейссеру

1.  Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синей 1 минуту, затем сливают краску.

2.  Промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30 секунд.

3.  Далее окрашивают везувином 1-3 мин.

4.  Промывают водой, высушивают.

Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина – в темно-синий, почти черный цвет.

Метод Бурри-Гинса (выявление капсулы)

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают кра­ситель, и для их выявления чаще всего применяют метод нега­тивного контрастирования.

Методика окраски по Бурри-Гинсу

1.  На середину предметного стекла наносят капельку черной туши и смешивают ее с каплей культуры капсульных бактерий с помощью петли.

2.  Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени го­релки.

3.  Окрашивают 5 минут карболовым фуксином, разведен­ным водой 1:3.

4.  Осторожно промывают водой, высушивают.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата.

Самостоятельная работа студента

на практическом занятии

Последовательность действий (этапы)	Способы действия (ориентиры)
I. Изучить метод окраски по Граму	1.  Внимательно проследите за демон­страцией преподавателем техники окраски по Граму. 2.  Поставьте опыт окраски по Граму. Цель опыта: определить, имеет ли метод Грама преимущество перед простым методом, и в чем оно состоит; опреде­лить, в каких случаях целесообразно применение метода окраски по Граму. Материал: стафилококки (грамположи­тельные бактерии) и кишечные палочки (грамотри-цательные бактерии). Ход опыта: приготовить три одинако­вых мазка из смеси стафилококков и кишечных палочек; окрасить один ма­зок водным фуксином, второй – генцианвиолетом, третий – по Граму. Результат: три рисунка и их описание. Вывод: (вывод содержит ответы на во­просы, поставленные в цели опыта).
II. Изучить метод окраски по Цилю-Нильсену	1. Внимательно проследите за демон­страцией преподавателем техники окраски по Цилю-Нильсену. 2. Поставьте опыт окраски по Цилю-Нильсену. Цель опыта: определить, имеет ли метод Циля-Нильсена преимущество перед простым способом окраски, и в чем оно состоит; в каких случаях целесо­образно применение этого метода. Материал: два мазка из смеси туберку­лезной палочки (кислотоустойчивые бактерии) и кишечных палочек (кислотоподатливые бактерии). Ход опыта: окрасьте один мазок про­стым способом (метиленовой синью), второй — по Цилю-Нильсену. Результат: два рисунка и их описание. Вывод. 3.  Изобразите критерии окраски по Ци­лю-Нильсену в виде схемы.
III. Сдать выполненную работу препода­вателю	Дайте на просмотр преподавателю пре­параты и тетрадь, приведите в порядок рабочее место и сдайте его дежурному студенту.
IV. Изучить капсулы бактерий	Промикроскопируйте и зарисуйте демон-страционный препарат из культу­ры палочки Фридлендера, окрашен­ный по способу Гинса; капсулы на ри­сунке укажите стрелкой.
V. Изучить споры бак­терий	Промикроскопируйте и зарисуйте мазок из культуры антракоидной палочки, окрашенной по способу Циля-Нильсена; споры на рисунке отметьте стрелкой.
VI. Изучить жгутики бактерий и подвиж-­ ность	1.  Внимательно проследите за демонстра­цией преподавателем техники приго­товления и микроскопирования пре­паратов «раздав-ленной» и «висячей» капли. Приготовьте препараты из культуры подвижных бактерий. 2.  Промикроскопируйте демонстрацион­ные пробирки с полужидким агаром, засеянные подвижными и неподвиж­ными микробами. Результаты зарисуйте и дайте объясне­ние их в дневник.
VII. Изучить включения бактерий	Промикроскопируйте и зарисуйте готовые мазки из культур дифтерийной и сенной палочек. Включения на рисунке отметьте стрел­кой и объясните в дневнике причину окраски тела и включений бактерий в разные цвета.
VIII. Изучить ультра- микроскопическую структуру бактерий	Посмотрите таблицы с электронограммами бактерий и обсудите вместе с преподавателем тонкую структуру клеточной стенки, строение цитоплазматической мембраны, включений.
IX. Сдать выполненную работу	Продемонстрируйте преподавателю приготов-ленные Вами препараты «раздавленной» и «висячей» капли, технику их микроскопии; дайте на просмотр преподавателю тетради; приведите в порядок рабочее место и сдайте его дежурному студенту.

Контрольные вопросы

1.  Перечислить основные этапы развития микробиологии и фамилии ученых, работы которых определили появление новых этапов.

2.  Перечислите основные открытия Л. Пастера, Р. Коха, .

3.  Назовите отрасли микробиологии.

4.  Основные разделы медицинской микробиологии.

5.  Классификационные категории в микробиологии. Что та­кое бинарная номенклатура?

6.  Как пишутся названия микробов (приведите примеры), группы микроорга­низмов?

7.  Основные формы бактерий.

8.  Как называются кокки, располагающиеся попарно? Цепоч­кой? Гроздьями? По четыре? Пакетами?

9.  Как называются палочки, образующие споры? Не обра­зующие споры?

10.  Как называются извитые формы с одним завитком спирали? С несколькими завитками спирали?

11.  Каким будет общее увеличение микроскопа: окуляр ×10, объектив 8? Окуляр ×10, объектив 40? Окуляр ×10, объектив 90?

12.  Чему равна разрешающая способность микроскопа с иммер­сионным объективом? Какова роль иммерсионного масла?

13.  Перечислите структурные элементы бактериальной клетки: постоянные и непостоянные.

14.  Оболочка бактерий, ее биологическая роль.

15.  Какую форму принимает цитоплазма, искусственно лишен­ная оболочки?

16.  Способ выявления оболочки.

17.  Капсула, ее биологическая роль у патогенных бактерий.

18.  Способ выявления капсулы в препаратах.

19.  Перечислите патогенные бактерии, образующие капсулу.

20.  Перечислите спорообразующие палочки.

21.  Биологическая роль спор.

22.  Процесс образования споры, условия и время, необходимые для этого процесса.

23.  Процесс прорастания вегетативных форм бактерий из спор.

24.  Как могут располагаться споры в теле бактерий?

25.  Способ выявления спор в препаратах.

26.  Включения бактерий, их биологическая роль, способ выяв­ления.

27.  Биологическая роль жгутиков у бактерий. Как можно уви­деть жгутики у бактерий?

Часть II

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Тема: «Питание и дыхание бактерий. Питательные среды.

Выделение чистых культур аэробов и анаэробов. Бактериологический метод исследования»

Цель:

– на основании знания особенностей физиологии мик­роорганизмов

научиться проводить бактериологиче­ский метод исследования.

Задачи:

– освоить механизм питания и дыхания бактерий;

– научиться методам культивирования аэробов и анаэробов;

– овладеть основными методами микробиологи­ческой техники;

– уметь выбрать питательную среду для культиви­рования микробов

(аэробов и анаэробов);

– овладеть методами выделения чистых культур и их

идентификации.

Изучение физиологических и биохимических свойств мик­робов требует специальных методик исследования, в соот­ветствии с чем в данном разделе изложены основы микробиоло­гической техники, методы выделения чистых культур, идентифи­кации, методы приготовления питательных сред, методы стери­лизации и т. д.

Знание бактериологических методов исследования патоло­гического материала служит основой для изучения всех после­дующих разделов микробиологической диагностики. Прежде всего, необходимо выделить чистую культуру бактерий. Для ее получения необходимо иметь питательные среды и владеть методами выделе­ния чистой культуры.

Для культивирования микроорганизмов в баклабораториях используются искусственные питательные среды.

По химическому составу и характеру биополимеров (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, липиды) прокариотические клетки не отличаются от эукариотических. Основными химическими компонентами бактериальной клетки являются органогены (кислород, водород, углерод, азот, фосфор). Процесс, в ходе которого бактериальная клетка получает из окружающей среды компоненты, необходимые для построения ее биополимеров, называется питанием.

Метаболизм бактерий представляет собой совокупность двух противо­положных, но взаимосвязанных процессов – катаболизма и анаболизма. Катаболизм (диссимиляция) – распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ. Ана­болизм (ассимиляция) – синтез веществ с затратой энергии. Метаболизм бак­терий исследуют с помощью биохимических и физико-химических методов в процессе культивирования бактерий в определенных условиях на питатель­ных средах, содержащих те или иные субстраты.

К особенностям метаболизма у бактерий относятся:

§  преобладание процессов диссимиляции над процессами ассимиляции;

§  высокая интенсивность процессов метаболизма, обусловленная тем, что соотношение поверхности к единице массы больше, чем у многоклеточных;

§  очень широкий субстратный спектр потребляемых бактериями ве­ществ – от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соеди­нений, включая антропогенные вещества – загрязнители окружающей среды;

§  очень широкий набор ферментов – это также способствует высокой интенсивности метаболических процессов.

Ферменты бактерий делятся на следующие группы: экзоферменты, вы­деляемые во внешнюю среду и действующие на субстрат вне клетки (напри­мер, протеазы, полисахаридазы, олигосахаридазы), и эндоферменты, дей­ствующие на субстраты внутри клетки (например, ферменты, расщепляю­щие аминокислоты, моносахары, синтетазы).

Синтез ферментов генетически детерминирован, но его регуляция идет за счет прямой и обратной связи, т. е. для одних ферментов репрессируется, а для других инициируется субстратом. Ферменты, синтез которых зависит от наличия соответствующего субстрата в среде (например, β-галактозидаза, β-лактамаза) называются индуцибельными. Другая группа ферментов, синтез которых не зависит от наличия субстрата в среде, называется конститутивными. Они в определенных концентрациях всегда содержатся в микробных клетках.

Для диагностики, изучения и в биотехнологических целях микроорганизмы культивируют на искусственных питательных средах.

Питательные среды. Методы выделения чистых культур бактерий

Цель:

– знать питательные среды, методы выделе­ния чистых культур

аэробных и анаэробных бактерий, методы стерилизации;

– уметь сделать посев для изолирова­ния колоний аэробных и для

культивирования анаэробных микроорганизмов.

Изучение разнообразных свойств бактерий может производиться в лаборатории только в условиях, когда микро­бам обеспечена возможность размножаться и проявлять свою жизнедеятельность. Одним из главных условий культивирования является применение соответствующих питательных сред. Питательные среды готовят из есте­ственных продуктов животного и растительного происхождения (мяса, молока, яиц, сыворотки крови, овощей, дрожжей, казеина и др.), из искусственно полученных из этих продуктов веществ (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта, кукуруз­ного экстракта и др.), или из химически чистых соединений с точно известным составом (аминокислот, углеводов, витаминов, минеральных солей).

В микробиологической промышленности существует много самых разнообразных питательных сред. В зависимости от их свойств, состава и назначения питательные среды делятся на несколько групп:

По происхождению:

·  естественные (молоко, желатин, картофель);

·  искусственные (приготовлены из специально подо­бранных природных компонентов, например: мясопептонные среды содержат мясной перевар, пептон и определенные концентрации солей);

·  синтетические (состоят из химических солей, амино­кислот, углеводов, витаминов и т. д.).

По консистенции:

(в зависимости от процентного содержа­ния агар-агара)	-  твердые (3-5% агар-агара);
-  полужидкие (0,3%, 0,5% и 0,7% агар-агара);
-  жидкие (0 % агар-агара).

По составу:

§  простые (мясопептонный агар – МПА, мясопептонный бульон – МПБ, пептонная вода);

§  сложные (мясопептонная основа и различные добавки, напри­мер: кровяной агар, сывороточный агар, полужидкие углеводные среды Гисса, сахарный бульон и др.).

По назначению:

© общего назначения – для культивирования боль­шинства бактерий (МПА, МПБ, кровяной агар и др.);

© специального назначения – для особых целей.

Среди них выделяют элективные и дифференциально-диагностические среды:

- желточно-солевой агар для стафилококков,

- щелочная пептонная вода для холерного вибриона;

- дифференциально-диагностические среды для энтеробактерий –

среды Эндо, Левина, Плоскирева.

Требования к питательным средам

1.  Питательность (содержание всех необходимых питательных веществ).

2.  Изотоничность (обеспечивает осмотическое равновесие меж­ду клеткой и средой, облегчает процессы осмоса и диффузии питательных веществ и продуктов метаболизма).

3.  Определенная рН (обеспечивает функционирование фермен­тов бактерий).

4.  Определенный Н-потенциал (обеспечивает окислительно-восстановитель­ные процессы в клетке бактерий; разный для аэробов и анаэробов).

5.  Стерильность (позволяет правильно учесть результаты).

6.  Прозрачность (позволяет увидеть рост бактерий).

Самостоятельная работа студента

на практическом занятии

1.  Приготовление чашек Петри с мясопептонным агаром.

2.  Приготовление скошенного мясопептонного агара.

3.  Посев культуры стафилококка на скошенный агар и в мясопептонный бульон.

4.  Просмотр демонстрации, оформление и подпись протоко­лов.

5.  Произвести посев смеси бактерий на чашку с питательной средой, обосновать цель высева.