Сборник научных трудов молодых ученых (стр. 4 )

Мелатонин угнетает канцерогенез кожи, индуцируемый бензпиреном у мышей, тормозит рост DMBA индуцированной аденокарциномы у самок крыс, обладает антиангиогенным эффектом. В физиологических концентрациях мелатонин тормозит рост ER позитивных (MCF – 7, T47D, ZR 75 -1) и некоторых ER негативных (MDA – MB - 468) клеточных линий РМЖ человека in vitro.

Применение М защищает клетки от антипролиферативного эффекта цисплатина и истощения внутриклеточного глутатиона. В модели опухоли поджелудочной железы у хомяка – комбинированное введение капецитабина и М усиливает противоопухолевый эффект цитостатика. Эти данные, а также результаты экспериментов на животных, в совокупности с низкой токсичностью М - явились триггером к началу исследований мелатонина в клинике с противоопухолевой целью. В двух мета-анализах было подтверждено увеличение общей выживаемости и объективного ответа опухоли на лечение в тех группах пациентов, в которых к традиционным методам лечения был добавлен М. Стандартная доза мелатонина составляла 20 мг на ночь в течение всего периода лечения. Таким образом, использование М ведет к существенному увеличению ответа опухоли на лечение, одногодичной выживаемости и снижению побочных эффектов химиотерапии.

Цель исследования

Исследование влияния совместного применения одного из наиболее распространенных и часто используемых в современной онкологии препаратов и группы антрациклиновы антибиотиков - доксорубицина (Д) в сочетании с М у мышей - самок SHR.

Задачи исследования

1. Оценить противоопухолевый эффект Д при его однократном в/б введении в дозе 5 мг/кг через 48 часов ППО;

2. Изучить эффект М при его подкожном введении, а также введении с питьевой водой;

3. Исследовать эффект сочетанного введения Д и М при обоих методах экспозиции.

Материалы и методы исследования

В исследовании использованы 61 самка мышей SHR весом 22-26 г, 3 мес. возраста. В начале опыта (день «0») опухоль Эрлиха была перевита всем мышам подкожно в правый бок в количестве 0,2 мл 10% суспензии клеток. Через 48 часов после перевивки опухоли, животные были рандомизированы на 6 групп.

1 группа - многофункциональный контроль - однократное в/б введение 0,2 мл 0.9% NaCl с 0,02 мл этанола, 0.9% NaCl п/к с 0,008 мл этилового спирта 5 раз в неделю -3 недели, (n=11)

2 группа – М в дозе 10 мг/кг п/к (по 0,2 мл раствора) в вечернее время 5 раз в неделю на протяжении 3 недель. (n=10)

3 группа – М в концентрации 10 мг/л с питьевой водой в вечернее время 5 последовательных дней в неделю на протяжении 3 недель. (n=10)

4 группа – Д в дозе 5 мг/кг в/б однократно в дневное время. (n=10)

5 группа – Д + М. Д, как в группе 4; М, как в группе 2. (n=10)

6 группа–. Д + М, Д как в группе 4; М – как в группе 3. (n=10)

Ежедневно осматривали всех животных и отмечали время появления опухолей. Регулярно (два раза в неделю) у животных измеряли длину и ширину опухолевых узлов. Эффективность терапии оценивали по торможению роста опухоли. Эксперимент был завершен через 39 дней после перевивки опухоли (ППО), когда в большинстве групп осталось около половины животных. Результаты, полученные при проведении экспериментов, были подвергнуты статистической обработке по методу Стъюдента с помощь компьютерной программы с целью установления достоверности выявленных различий. Различия считались достоверными при р < 0,05.

Результаты исследования

В группе 2 подкожное введение М в дозе 10 мг/кг по 0, 2 мл в вечернее время 5 раз в неделю на протяжении 3 недель) стабильно только с 28-го дня ППО и до конца эксперимента (39-й день ППО) приводило к торможению роста опухоли (от 4% до 45%), однако эти результаты не достигали статистической достоверности по сравнению с контрольной группой мышей (р=0.93, 0.43, 0.08 0.1047). В 3 группе при введении М с питьевой водой в концентрации 10 мг/л в вечернее время на протяжении 3 недель тенденцию к торможению роста опухоли наблюдали на 25-й и 28-й день ППО (р=0.935 и 0.816 соответственно) и 35-й и 39-й день ППО (р=0.277 и 0.2373 соответственно). В группе 4 однократное введение Д в дозе 5 мг/кг приводило к торможению роста опухоли только в конце эксперимента – 35-й и 39-й день ППО, причем по сравнению с контрольной группой различия были статистически достоверными (p = 0,01) только на 39-й день ППО (60%). В группе 5 сочетанное введение Д и М (п/к 10 мг/кг) приводило к торможению роста опухоли на всем протяжении опыта по сравнению с контрольной группой мышей, причем статистически достоверные различия отмечали на протяжении от 31-го до 39-го дня ППО на 47-62%. При сравнении с мышами, получавшими только Д (гр. 4), в группе сочетанного введения Д и М, наблюдали более выраженное торможение роста опухоли на протяжении всего эксперимента, при этом статистически достоверные или близкие к достоверным различия были отмечены с 25-го по 35-й день ППО (p = 0,01; 0,05;0,06; 0,07). По сравнению с группой животных, получавших только М п/к (гр. 3), не обнаружено статистически достоверных различий. В группе 6 при введении Д и М с питьевой водой (10 мг/л) на протяжении всего эксперимента отмечали торможение роста опухоли (за исключением 14-го дня ППО) по сравнению с контрольными животными, причем статистически достоверные различия (p = 0,004; 0,027; 0,048) отмечали в последние 10 дней опыта (с 28-го по 39-й день ППО) – (от 51% до 68% торможения роста опухоли). По сравнению с группой мышей, получавших только однократно Д (гр. 4), противоопухолевый эффект был более выраженным, статистически достоверные различия или близкие к достоверным различия в торможении роста опухоли отмечали с 25-го по 35-й день ППО (p = 0,02; 0,03; 0,05, 0,07). При сравнении с группой животных, получавших толькоМ с питьевой водой (гр. 3), не было отмечено статистически достоверно торможения роста опухоли, хотя тенденция к снижению объема опухоли наблюдалась на протяжении всего эксперимента.

Выводы

1.  Сочетанное введение Д и М приводило к выраженному противоопухолевому эффекту, проявлявшемуся в статистически достоверном или близкому к достоверному торможению роста опухоли (по сравнению с контролем) на 42 – 68%.

2.  Противоопухолевый эффект такого сочетанного воздействия Д и М был статистически достоверно более выраженным по сравнению с данными у мышей, получавших только Д.

АНАЛИЗ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ KRAS И BRAF В ОПУХОЛЯХ

Младший научный сотрудник

лаборатории генно-инженерных методов исследования

ФГБУ «НИИ молекулярной биологии и биофизики»

Новосибирск

Продукты генов K-ras и B-raf являются компонентами RAS-MAPK сигнального каскада, который регулирует пролиферацию и выживание клеток в ответ на внешние митогенные стимулы.

Активирующие мутации BRAF встречаются в 60% случаев при меланоме кожи. Мутация V600E составляет 82% случаев мутаций в гене BRAF при меланоме кожи. Пациентам с мутацией BRAF V600E при меланоме кожи показано лечение с помощью таргетной терапии низкомолекулярным ингибитором BRAF-киназы вемурафенибом или дабрафенибом. Активирующие мутации 12 и 13 кодонов KRAS встречаются в 30-50% случаев при лечении рака толстой и прямой кишки (РТПК) и являются маркером неэффективности таргетной терапии анти-EGFR антителами.

Ранее было показано, что около 2-3% больных с НМРЛ имеют соматические мутации BRAF V600 и по предварительным данным такие опухоли могут быть также чувствительны к таргетной терапии. Другой мало изученный с точки зрения молекулярно-генетического профили тип опухоли – карциноид. Существуют ограниченные данные о наличии мутаций BRAF в этих опухолях. Поэтому представляет интерес анализ мутаций BRAF при НМРЛ и карциноиде в российской популяции.

Одним из наиболее чувствительных методов анализа мутаций является аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени. Этот метод позволяет выявлять 1% мутантной ДНК в образце. Такая чувствительность позволяет проводить анализ мутации в образцах опухоли, содержащих 2-5% и более опухолевых клеток среди нормальной ткани. Разработан метод анализа мутаций на основе аллель-специфичной ПЦР и проведено его сравнение с секвенированием по Сэнгеру и пиросеквенированием, а также определена аналитическая чувствительность всех используемых методов.

Секвенирование ДНК по Сэнгеру это самый распространённый метод анализа мутаций. Однако метод обладает низкой чувствительностью около 20%, что недостаточно при анализе соматических мутаций в опухолях. Для увеличения чувствительности секвенирования использовали недавнюю разработку в области химии олигонуклетотидов – LNA (locked nucleic acid) модифицированные олигонуклеотиды, которая ранее не использовалась для секвенирования.

Цель и задачи исследования

Анализ соматических мутаций в генах KRAS и BRAF в опухолях колоректального рака и меланомы кожи у российских пациентов.

Материалы и методы исследования

Материал - срезы опухолевой ткани в парафине.

Разработка методов анализа мутаций BRAF и KRAS

Были разработаны два аллель-специфичных ПЦР-теста для детекции мутаций BRAF V600 по смысловой и антисмысловой цепям ДНК. Аналитическая чувствительность, то есть минимальное содержание ДНК с мутацией в образце необходимое для определения мутации, была определена в тестировании положительных ДНК-стандартов, содержащих 1-10%, аллеля BRAF V600E. ПЦР-тесты показали аналитическую чувствительность 1%.

Мы разработали ПЦР тест, который имеет 7 аллель-специфичных праймеров для определения 7 мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS. Также был разработан вариант аллель-специфического ПЦР теста с только одной парой праймеров и LNA-блокером. LNA-блокер это олигонуклеотид, который имеет последовательность дикого типа 12 и 13 кодонов гена KRAS, поэтому прочно связывается с ДНК KRAS дикого типа и подавляет ее амплификацию, но не препятствует амплификации ДНК с мутацией. Разработанные ПЦР-тесты имели аналитическую чувствительность 5%.

Методы аллель-специфической ПЦР для анализа мутаций KRAS и BRAF были валидированы на 88 образцах ДНК меланомы кожи и РТПК. Методы показали высокую чувствительность (95-100%) и специфичность (100%) при анализе мутаций в клиническом опухолевом материале.

При использовании пиросеквенирования для анализа мутаций юыло показано что метод обладает высокой чувствительностью 1% в отношении анализа мутаций BRAF V600, но для мутаций KRAS чувствительность составляет только 20%.

При использовании традиционного секвенирования мутацию удавалось обнаружить только при содержании ее в образце 20% и более, тогда как с LNA-блокером чувствительность увеличивалась до 1%.

Определение частот мутаций KRAS и BRAF у российских пациентов

Мутации BRAF V600 были обнаружены в 30 из 51 случаев (59%) . Среди случаев с мутациями мы обнаружили следующие мутации: V600E в 25/30 (5%), V600К в 3/22 (14%), V600E2 в 2/22 (5%). При анализе мутаций BRAF V600 при НМРЛ в 292 образцах не было обнаружено случаев с мутациями. Анализ 85 ФФЗП образцов карциноидов выявил 2 случая с мутацией BRAF V600E. Мутации 12 и 13 кодонов KRAS были обнаружены в 37 из 18 (45,7%) образцов ДНК. Среди 37 случаев с мутациями были обнаружены следующие генотипы: G13D в 12/37 (32,4%) случаев, G12D в 11/37 (29,7%) случаев, G12V в 5/37 (13,5%) случаев, G12C в 4/37 (10,8%) случаев, G12A в 3/37 (8,1%) случаев, G12S в 2/37 (5,4%) случаев, G13R в 1/37 (2,7%) случаев. Один из образцов содержал одновременно две мутации: G13D и G12V. Данные согласуются с частотами мутаций в других станах.

Результаты исследования

Секвенирование по Сэнгеру является наиболее распространенным методом анализа мутаций с известными недостатками: низкую аналитическую чувствительность метода (не менее 20% опухолевой ДНК в образце), высокий риск контаминации, значительную трудоемкость. Проблема низкой чувствительности секвенирования может быть решена с помощью LNA-блокера или предварительной макродиссекции.

Пиросеквенирование имеет такие же недостатки с преимуществом перед секвенированием по Сэнгеру в виде чувствительности 1% ДНК с мутацией BRAF V600, хотя для мутаций KRAS чувствительность составляет 20

Для диагностики мутаций BRAF в Европе и США применяются коммерческие тест-системы на основе ПЦР в режиме реального времени не доступные в России из-за стоимости (стоимость регентов для анализа 1 образца около 8600 руб. для наборов компании Roche).

Нами был разработан высокочувствительный метод для диагностики мутаций BRAF V600 и 12,13 кодонов KRAS на основе метода ПЦР в режиме реального времени. Высокая чувствительность ПЦР-тестов, составляющая 1-5% опухолевой ДНК в образце, делает метод удобным для анализа соматических мутаций в ДНК. Аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени позволяет определять и более редкие варианты мутаций KRAS и BRAF, которые также являются маркерами чувствительности к таргетной терапии.

Выводы

1.  Аллель-специфичная ПЦР в режиме реального времени является высокочувствительным методом для анализа соматических мутаций KRAS и BRAF

2.  Пиросеквенирование является высокочувствительным методом для анализа соматических мутаций BRAF V600, но не достаточно чувствительным для анализа мутаций KRAS

3.  Использование LNA-блокеров в ПЦР позволяет увеличить до 1-5% чувствительность аллель-специфичной ПЦР и секвенирования по Сэнгеру

4.  Частота мутаций BRAF V600 при меланоме кожи у российских пациентов согласуется с данными исследований в других странах

5.  В российской популяции на выборке в 292 образца НМРЛ мутаций BRAF не обнаружено, что также согласуется с данными некоторых исследований в других странах

6.  Частота и спектр мутаций KRAS при РТПК у российских пациентов согласуется с другими российскими и зарубежными исследованиями

7.  Обнаруженные случаи мутаций BRAF и KRAS в карциноидных опухолях имеют важное значение для поиска молекулярных мишеней для таргетной терапии

В настоящее время методы диагностики мутаций BRAF и KRAS, разработанные в этом исследовании, применяются для диагностики мутаций лабораторией генодиагностики ООО «БиоЛинк».

ОПЫТ ЛАПАРОСКОПИЧЕСКИХ ОПЕРАЦИЙ

У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЭНДОМЕТРИЯ СТАРШЕ 70 ЛЕТ

Клинический ординатор кафедры онкологии

ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский

университет им. » Минздрава России

Санкт-Петербург

Рак эндометрия – самое частое заболевание в структуре онкогинекологических заболеваний. Мировая статистика свидетельствует о существенном увеличении РТМ у женщин в экономически развитых странах, такая же тенденция характерна и для России.

В настоящее время доказано несомненное преимущество лапароскопических операций при начальных формах рака эндометрия перед открытой хирургией. Такие показатели, как: время оперативного вмешательства, радикальность операции, количество удаленных лимфатических узлов не уступают вмешательствам из лапаротомного доступа. При этом лапароскопические вмешательства характеризуются меньшей кровопотерей, снижением болевого послеоперационного синдрома, быстрого восстановления трудовой активности и короткого койко-дня.

Сложность в лечении данных пациентов возникает из-за наличия большого количества сопутствующих патологий, и, как следствие, наличие высокого индекса коморбидности – наличия нескольких параллельно текущих заболеваний, которые могут влиять на течение друг на друга. По данным некоторых авторов до 95% лиц старше 65 лет имеют несколько параллельно текущих хронических заболеваний.

Цель и задачи исследования

Учитывая, что в пожилом возрасте снижаются скорости метаболических процессов, угнетаются естественные защитные механизмы организма и снижается скорость регенерации тканей и органов, необходимо изучение и сравнение методов хирургического лечения у лиц пожилого и старческого возраста.

Материалы и методы исследования

С целью изучения и возможности применения лапароскопии в лечении рака тела матки (РТМ) у женщин пожилого и старческого возраста, на базе онкогинекологического отделения ФГБУ «НИИ онкологии им. » МЗ РФ, проведено ретроспективное исследование, в которое вошли 28 женщин старше 70 лет, прооперированные лапароскопическим доступом с 2012 по декабрь 2014 года. Средний возраст пациенток составил 77,1 (70-88) лет. В контрольную группу вошли 30 больных РТМ старше 70 лет, прооперированные лапаротомным доступом в тот же временной период.

На предоперацинном этапе всем больным проводилось комплексное обследование, включающее: клинический и биохимический анализ крови; общий анализ мочи; рентген органов грудной клетки; электрокардиография; УЗИ органов брюшной полости и малого таза; УЗИ сосудов нижних конечностей; эхокардиография; эзофагогастродуоденоскопия.

Соматический статус пациентов был оценен по шкале анестезиологического риска ASА, и минимально был равен III, что соответствует высокому риску анестезии. Также был оценен индекс коморбидности по шкале Чарлсона, который, в среднем, составил 5,2 единицы, что соответствует прогнозу 10-летней выживаемости, по соматическим показателям, около 24%. Из сопутствующих заболеваний у 100% пациенток поставлен диагноз гипертоническая болезнь II и III стадии, 96% пациенток страдали ишемической болезнью сердца и хронической сердечной недостаточностью. У 67% пациенток присутствовало ожирение различной степени, 50% пациенток болели сахарным диабетом 2 типа. У трети больных были операции на брюшной полости в анамнезе. В послеоперационном периоде всем больным проведена профилактика тромбоэмболических осложнений: компрессионный трикотаж + ранняя активизация + п/к введение низкомолекулярного гепарина; также проводилась антибиотикопрофилактика.

Больным с Ib и выше стадиями заболевания в послеоперационном периоде проводилась лучевая терапия.

Результаты исследования

Всем больным группы исследования была выполнена лапароскопическая экстирпация матки с придатками (пангистерэктомия). У 14 пациенток (50%), по показаниям (размер опухоли более 2 сантиметров в диаметре, инвазия более ½ миометрия, умеренно - и низко - дифференцированный тип опухоли) операция была дополнена двухсторонней подвздошной лимфаденэктомией. Средняя кровопотеря составила около 40 мл. Среднее время операции при выполнении ПГЭ составило 95 минут, а с лимфаденэктомией – 173 минуты. В 1 случае, по причине обширного спаечного процесса, была выполнена конверсия в лапаротомию. Более подробные данные и сравнение с лапаротомической группой представлены в таблице 1.

Таблица 1. Периоперационные показатели пациентов.

	Лапароскопическая группа, N=28	Лапаротомическая группа, N=30
Пангистерэктомия Среднее время операции (мин.)	14 (50%) 95 (60-190)	10 (33,3%) 105 (70-150)
Пангистерэктомия +лимфаденэктомия Среднее время операции (мин.)	14 (50%) 173 (120-210)	20 (66,6%) 145 (95-170)
Резекция большого сальника	1 (3.5%)	9 (30%)
Средняя кровопотеря (мл.)	40	310 (200-700)
Гемотранзфузия	-	2
Спаечный процесс	6 (21.5%)	-
Конверсия в лапаротомию*	1 (3.5%)	-

*по причине обширного спаечного процесса

В послеоперационном периоде у 4(14.2%) пациентов отмечались послеоперационные осложнения: у 2 пациентов образовались лимфокисты до 10 см в диаметре, еще у 2 пациентов длительное время (до 10 суток) сохранялась обильная лимфоррея. Все осложнения купированы консервативными методами. Других осложнений не отмечалось. Более подробные послеоперационные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Послеоперационные результаты, морфологическая характеристика и отдаленные результаты.

	Лапароскопическая группа	Лапаротомическая группа
Послеоперационные осложнения Лимфокисты (V>100 мл) длительная лимфоррея (до 10 суток) нагноение послеоперационной раны атония кишечника ТЭЛА	2 (7,1%) 2 (7,1%) - - -	2 1 2 1 2
Послеоперационная стадия (FIGO) IА IВ II IIIВ* IV	15 (17,8 %) 7 (66%) 4 (14,2%) 2 (7,1%) -	10 (33,3%) 12 (40%) 3 (10%) 5 (16,6%) 4**
Эндометриоидная опухоль Высокодифференцированная опухоль Умереннодифференцированная опухоль Низкодифференцированная опухоль	8 (28,5%) 14 (50%) 3 (10,7%)	3 (10%) 15 (50%) 3 (10%)
Смешанная (эндометриоидная + серозная)	1 (7,1%)	2 (6,6%)
Светлоклеточная	-	2 (6,6%)
Серозная	1	6 (20%)
Рецидив	1  (3,5%)	3 (10%)

*у больных при гистологическом исследовании выявлены метастазы в подвздошных лимфоузлах

** из них: 3 больных с серозной аденокарциномой, метастатическим

поражением большого сальника и брюшины. 1 больная с эндометриоидной

аденокарциномой, метастазами в яичник и большой сальник.

На момент написания статьи при дальнейшем наблюдении у 1 пациентки, прооперированной лапароскопически, с IIIB стадией заболевания, через 10 месяцев после оперативного лечения развился рецидив в виде метастазов в паховые лимфоузлы и мягкие ткани лобковой области. У контрольной группы больных, при дальнейшем наблюдении, диагностировано 3 рецидива заболевания, из них 1 рецидив в парааортальных лимфоузлах и 2 местных рецидива.

Полученные результаты также показывают на отсутствие статистически значимых различий в качестве оперативного лечения и сравнения выживаемости, между больными прооперированными лапароскопическим и лапаротомическим методами.

Выводы

1.  Проведенное исследование показало хорошие непосредственные результаты лечения данной группы пациентов.

2.  Хирургическое лечение показано больным раком эндометрия пожилого и старческого возраста.

3.  При выборе тактики и объемов лечения стоит ориентироваться на выраженность и тяжесть сопутствующих патологий, а сам возраст не является противопоказанием к оперативному лечению и ограничению объемов операции.

СОЗДАНИЕ МОДЕЛИ HER2/NEU-ПОЗИТИВНОЙ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ОПУХОЛИ НА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ МЫШАХ

Младший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии

ФГУП «Государственный научно-исследовательский

институт особо чистых биопрепаратов»

Санкт-Петербург

Семейство рецепторов эпидермального фактора роста является перспективной мишенью для таргетной терапии – наиболее привлекательного подхода в лечении онкологических заболеваний. Особое внимание уделяется развитию анти-HER2 стратегий, так как сверхэкспрессия данного рецептора имеет место в 25-30 % случаев рака молочной железы – самого распространенного онкологического заболевания женщин. Разработка новых терапевтических антител стимулирует поиск удобных и доступных моделей для их испытания, позволяющих ускорить внедрение препаратов в клинику.

Цель исследования

Создание простой в воспроизведении в условиях обычного вивария модели перевиваемой опухоли у иммунокомпетентных мышей для тестирования антител к рецептору HER2/neu.

Задачи исследования

1. Создать генетическую конструкцию для экспрессии рецептора HER2/neu в эукариотических клетках;

2. Получить мышиную линию клеток MH-22a, экспрессирующую HER2/neu;

3. Отработать модель экспериментальной опухоли с помощью туморогенной клеточной линии MH-22a, экспрессирующей рецептор HER2/neu;

4. Изучить влияние коммерческого препарата Герцептин® на рост экспериментальной опухоли.

Научная новизна исследования

Впервые показано поэтапное создание модели HER2/neu-позитивной перевиваемой опухоли с использованием линии MH-22a на иммунокомпетентных мышах.

Доказано сохранение экспрессии человеческого рецептора на поверхности клеток мышиной опухоли in vivo на протяжении, как минимум, трех недель.

Продемонстрирована возможность тестирования терапевтических антител к рецептору HER2/neu на этой модели.

Практическая значимость исследования

Данная работа носит прикладной характер. Созданная модель проста в воспроизведении и выгодна с экономической точки зрения. Можно предположить, что ее применение при скрининге терапевтических и визуализирующих анти-HER2-антител позволит исключить расходы на покупку или получение генно-инженерных мышиных моделей, а также содержание бестимусных мышей в стерильных условиях, что в конечном итоге будет способствовать снижению рыночной стоимости препаратов, делая их доступными для пациентов.

Материалы и методы исследования

В работе использовали следующие клеточные линии: A-549 (легочная аденокарцинома человека), U-2 OS (остеосаркома человека), HeLa (аденокарцинома шейки матки человека), CaCo-2 (аденокарцинома ободочной кишки человека), CHO (клетки яичников китайского хомячка) и MH-22a (гепатома мыши), полученные из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (СПб).

Фрагмент гена, кодирующий экстраклеточный, трансмембранный и часть цитоплазматического домена рецептора HER2/neu, был клонирован в плазмиду для эукариотической экспрессии pIRES-neo3 («Clontech», США).

Трансфекцию выполняли, используя липосомальный реагент Turbofect («Fermentas»). В качестве селективного антибиотика для стабильной трансфекции использовали G-418 («Invitrogen», США). Клонирование пула проводили методом серийных разведений.

Для иммуноцитохимического окрашивания клетки фиксировали на покровных стеклах в холодном ацетоне. При окрашивании использовали биотинилированные anti-human-HER2 антитела («eBioscience», США). Для цитофлюориметрического анализа клетки снимали холодным раствором Версена («Биолот», Россия). Далее инкубировали с биотинилированными anti-human-HER-2 антителами, затем с конъюгатом стрептавидин – фикоэритрин («eBioscience»). Экспрессию HER2/neu оценивали на проточном цитофлюориметре Epics XL («Beckman Coulter», США).

Инокуляцию опухолей проводили путем подкожного введения суспензии клеток самцам мышей сингенной линии DBA (питомник лабораторных животных «Рапполово», Россия). Размеры опухоли измеряли штангенциркулем, объем рассчитывали по формуле: V = a×b2/2, где a - больший, b – меньший линейный размер опухолевого узла.

Достоверность различий размеров опухолей между группами оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p<0.05.

Результаты исследования

На первом этапе работы была клонирована часть гена HER2/neu, кодирующая фрагмент цитоплазматического, трансмембранный и экстраклеточный домены рецептора, и получена генетическая конструкция для экспрессии данного белка в эукариотических клетках. Затем с помощью созданного вектора была проведена трансфекция клеток туморогенной линии мышиной гепатомы MH-22a с последующим клонированием стабильно трансфецированного пула. В результате был отобран клон G10 с высокой экспрессией рецептора HER2/neu, подтвержденной иммуноцитохимически и цитофлюориметрически.

Для оценки стабильности экспрессии без селектирующего давления часть клеток G10 культивировали в течение 40 дней в среде без G-418. Несмотря на падение относительной интенсивности экспрессии по сравнению с клетками, растущими в среде с антибиотиком, все клетки остались HER2/neu-позитивными.

При подкожном введении мышам клеток MH-22a или G10 пальпируемые образования в месте инъекции обнаруживались на 5-7 сутки и увеличивались в размерах, как правило, до момента вскрытия на 15 сутки. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов опухоли показало, что на протяжении, как минимум, 15 суток экспрессия рецептора HER2/neu на поверхности клеток опухоли сохраняется.

В качестве испытания экспериментальной опухоли был проведен следующий эксперимент: после введения клеток G10 двум группам мышей животные одной из групп получали внутрибрюшинные инъекции Герцептина®, а другие оставались интактными. Измерения опухолей в данном эксперименте проводили на 10, 13, 16 и 20 сутки после введения. До 16 суток включительно в опытной группе размеры опухолей были достоверно ниже, чем в контрольной.

Параллельно с экспериментом на животных, клетки, использовавшиеся для введения, продолжали культивировать, исключив из среды G-418. Через 21 сутки был произведен забой животных, во время которого часть клеток опухоли переводили в культуру и через 1-2 пассажа оценивали уровень экспрессии рецептора цитофлюориметрически. Средние значения флюоресценции (MFI) в обеих группах были примерно в 3-5 раз ниже, чем у клеток G10, культивировавшихся in vitro без G-418, вероятно, вследствие давления иммунного ответа на чужеродный белок in vivo. При этом в группе с лечением MFI были достоверно ниже, чем в контрольной, что указывает на отбор на фоне терапии Герцептином® клеток со сниженной экспрессией HER2/neu. В данном случае, вероятно, имеет место то же явление, что наблюдается у пациентов, перестающих отвечать на терапию Герцептином®.

Выводы

1. C помощью постоянной трансфекции получен клон G10 мышиной клеточной линии MH-22a cо стабильной высокой экспрессией человеческого рецептора HER2/neu на поверхности.

2. При подкожном введении сингенным мышам клеток G10 образуется солидная опухоль, в которой сохраняется экспрессия HER2/neu на протяжении, как минимум, трех недель.

3. Терапия Герцептином® приводит к достоверному торможению роста экспериментальной опухоли, а также способствует отбору в опухоли клеток со сниженной экспрессией человеческого рецептора.