Результаты исследования проведенного внедрены в практическую работу лаборатории медицинской генетики, отделения гематологии клиники ГБОУ ВПО Рост ГМУ Минздрава России, отделений гематологии республиканских, краевых и областных онкологических диспансеров Южного Федерального и Северо-Кавказского Федерального округов.
Личное участие диссертанта
Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов, сборе первичных данных, проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи. Математическая обработка данных проведена лично соискателем. Написание глав собственных исследований, обсуждение результатов, формулировка выводов и практических рекомендаций выполнено автором самостоятельно.
Структура и объем работы
Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы обзора литературы, главы описания методики исследования, трех глав результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии (18 источников на русском и 177 на иностранном языках). Работа содержит 27 рисунков и 15 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы
Материалом для данного исследования явились клинико-лабораторные данные 368 пациентов (соотношение мужчины/женщины – 167/201) с цитогенетически подтвержденным (Ph-позитивным) ХМЛ. Критериями включения в исследование пациентов с диагнозом ХМЛ явились: наличие хронической фазы или фазы акселерации заболевания, терапия иматинибом в дозе 400-800 мг/сут., длительность терапии иматинибом более 18 месяцев (без учёта предлеченности и длительности заболевания до назначения иматиниба). Критериями исключения – терапия ингибиторами тирозинкиназ II поколения. Медиана длительности терапии составила 30 месяцев (18-120 месяцев).
В течение первых трех лет терапии иматинибом мониторинговые цитогенетические и молекулярно-генетические исследования выполнялись каждые 6 месяцев после начала приема иматиниба. В дальнейшем исследования выполнялись 1 раз в 12 месяцев.
В работе использовались критерии цитогенетического и молекулярного ответов (табл.1), а также критерии оптимального, субоптимального и неудовлетворительного ответов (табл. 2) на терапию ХМЛ ингибиторами тирозиникназ, предложенные Европейским обществом по лечению лейкозов – ELN (M. Baccarani et al., 2009).
Таблица 1. Критерии цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом
Ответ на терапию | Критерии определения |
Цитогенетический ответ | |
Полный цитогенетический ответ (ПЦО) | 0% Ph+ клеток КМ |
Частичный цитогенетический ответ (ЧЦО) | ≤35% Ph+ клеток КМ |
Малый цитогенетический ответ (МЦО) | 36–65 % Ph+ клеток КМ |
Минимальный цитогенетический ответ (МинЦО) | 66–95 % Ph+ клеток КМ |
Отсутствие цитогенетического ответа (ОЦО) | ≥95% Ph+ клеток КМ |
Молекулярный ответ | |
Полный молекулярный ответ (ПМО) | Транскрипт BCR–ABL не определяется |
Большой молекулярный ответ (БМО) | Низкий уровень экспресии: отношение уровня транскрипта BCR-ABL к уровню транскрипта контрольного гена (ABL) менее 0,1% (IS) |
Отсутствие большого молекулярного ответа (ОБМО) | Умеренная экспрессия гена BCR-ABL: значение уровня транскрипта BCR-ABL по отношению к уровню транскрипта контрольного гена (ABL) от 0,1% до 1,0% Высокий уровень экспрессии: уровень транскрипта BCR-ABL по отношению к уровню транскрипта контрольного гена (ABL) ≥ 1% |
Таблица 2. Критерии отсутствия ответа, субоптимального и оптимального ответов на терапию ХМЛ иматинибом
Время терапии | Отсутствие ответа | Субоптимальный ответ | Оптимальный ответ |
3 мес. | Отсутствие ГО | --- | МЦО (Ph+ 36–65 %) |
6 мес. | Отсутствие ЦО (Ph+ 96–100%) | Отсутствие ЧЦО (Ph+ >35%) | ЧЦО (Ph+ ≤35%) |
12 мес. | Отсутствие ЧЦО (Ph+ >35%) | Отсутствие ПЦО (Ph+ 0%) | ПЦО (Ph+ 0%) |
18 мес. | Отсутствие ПЦО (Ph+ 0%) | Отсутствие БМО | БМО |
Обследованные пациенты разделены на 3 группы в зависимости от эффективности лечения иматинибом в соответствии с критериями ELN (табл.3). Первую группу составили пациенты (n=118) с оптимальным ответом на терапию иматинибом. Вторую группу (n=35) – пациенты с субоптимальным ответом. Третью – пациенты (n=215) с отсутствием ответа на проводимую терапию. В свою очередь в последней группе выделены пациенты с первичной резистентностью к проводимой терапии ХМЛ иматинибом, и пациенты с вторичной резистентностью. В качестве критерия вторичной резистентности (рецидива) рассматривались утрата достигнутого цитогенетического и/или молекулярного ответа, как при оптимальном, так и субоптимальном ответах на терапию иматинибом.
Таблица 3. Общая характеристика пациентов, включенных в исследование
Группы пациентов | Ответ на терапию | Число пациентов (муж./жен.) медиана возраста | ||
1 | Оптимальный ответ | 118 (60/58) 52,7 года | ||
2 | Субоптимальный ответ | 35 (12/23) 51,6 года | ||
3 | Резистентность | Первичная | 215 (95/120) 47,9 года | 145 (69/74) 47,5 года |
Вторичная | 70 (26/44) 49,4 года | |||
Общее количество | 368 (167/201) 49,6 года |
Для выявления мутаций гена BCR-ABL исследовали нуклеотидную последовательности кДНК киназного домена гена BCR-ABL по оригинальной методике с одноэтапной амплификацией. РНК выделяли из образцов крови гуанидин-тиоционат хлороформ-фенольным методом. Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор RT-Dx Kit («IPSOGEN»). Амплификация интересующего фрагмента кДНК гена BCR-ABL производилась в один этап. Для амплификации использовались: 5’BCR праймер – F – gaagtgtttcagaagcttctc и 3’ABL праймер – R – tccatgcggtagtccttctc. Амплифицировали участок длиной 1407 пн (в случае варианта b2a2 гена BCR-ABL) или 1482 пн (при варианте b3a2). Реакция выполнена в 20 мкл общего объема смеси, содержащей 8 мкл очищенной воды («Sigma»), 5 мкл полученной кДНК, 4 мкл 5-кратного ПЦР-буфера (12,5мМ MgCl2), 0,3 мкл TaqF ДНК-полимераза («АмплиСенс»), 2 мкл смеси dNTP и по 0,5 мкл каждого праймера. Реакцию амплификации проводили по схеме: 94 0С, 10 мин; 45 циклов:940С – 30 сек, 640С – 30 сек, 700С – 120 сек; 700С – 5 мин.
Результаты оценивались путем проведения горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле. Ампликоны кДНК BCR-ABL выделяли из геля и очищали методом сорбции на борсиликатной мембране с помощью колонок AxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit («Axygen»). Реакцию секвенирования проводили с помощью наборов Beckman Coulter Genome Lab Method Development Kit («Beckman Coulter») и праймеров собственного дизайна. После проведения реакции, продукты ее очищались и подвергались капиллярному электрофорезу с использованием генетического анализатора Beckman Coulter CEQ-8000. Анализ нуклеотидной последовательности и поиск мутаций проводился при помощи программного обеспечении CEQ-8000 Genetic Analysis System v.6.0.75 («Beckman Coulter»). Референтная последовательность ДНК, мРНК гена ABL, а также аминокислотная последовательность ABL-тирозинкиназы получена из баз данных «The National Center for Biotechnology Information» (NCBI): http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ (U. S.Department of Health and Human Services, http://www. nih. gov/).
Для определения дополнительных копий гена BCR-ABL проводили молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH). Для определения слитного гена BCR-ABL использовались гибридизационные пробы к локусам 9q34 (ABL) и 22q11 (BCR) Vysis® LSI® BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe («Abbott»). Пробоподготовка и исследование проводилось согласно протоколу производителя. Анализу подвергались не менее 200 интерфазных ядер клеток костного мозга. При необходимости, в случае обнаружения менее 2-х ядер с искомой аномалией на 200 проанализированных, число анализируемых ядер увеличивали в 3-5 раз (до 600-1000 интерфазных ядер), с целью подтверждения наличия аберрации и уточнения величины [amp(BCR-ABL)+] клона.
Процедура статистической обработки полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1 и электронных таблиц MS Excel 2007 - 2010. Расчеты выполнены в соответствии с рекомендациями (2002) по обработке численных результатов экспериментов в медицине. Анализ включал определение медианы возраста, длительности терапии иматинибом, длительности предшествующей иматинибу терапии, выживаемости (общей и безрецидивной) для каждой группы наблюдения, определение частоты мутаций и амплификации гена BCR-ABL, в зависимости от фазы заболевания и вида резистентности, а также изменение указанной частоты от длительности рефрактерного течения. Методом множительных оценок Каплана-Мейра проведен анализ вероятности достижения большого, полного цитогенетического и большого молекулярного ответов в зависимости от наличия или отсутствия мутаций киназного домена гена BCR-ABL, а также в зависимости от появления дополнительных копий BCR-ABL в исследованных группах. Проведен дискриминантный анализ позволяющий выделить признаки, в наибольшей степени ответственные за различия между группами исследованных пациентов. Проверка соответствия изучаемых данных нормальному распределению проведена с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для сравнения бинарных данных использовались точный критерий Фишера и c2. Для изучения связи изучаемых показателей использовали параметрический корреляционный анализ Пирсона (r), а также непараметрические методы корреляционного анализа Спирмена (r).
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 |
