Роль аномалий гена BCR-ABL в развитии резистентности к терапии иматинибом у больных хроническим миелоидным лейкозом (стр. 3 )

Исследования проводились в течение 5 лет (2007 - 2012гг.) на базе лаборатории медицинской генетики Ростовского государственного медицинского университета.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние мутаций киназного домена гена BCR-ABL на развитие резистентности у пациентов с ХМЛ к терапии иматинибом.

Для выяснения роли мутаций гена BCR-ABL в развитии невосприимчивости к терапии ХМЛ иматинибом проведено определение нуклеотидной последовательности киназного домена гена BCR-ABL у 104 больных ХМЛ (56 мужчин и 48 женщин) с первичной и вторичной резистентностью, из которых в хронической фазе заболевания находилось 80 человек, в фазе акселерации – 24 человека. Мутации гена BCR-ABL обнаружены у 42 больных (21 – муж., 21 – жен.) из 104, что составило 40,4% от всех изученных резистентных случаев. При этом в группе пациентов находящихся в хронической фазе ХМЛ мутации киназного домена обнаружены у 28 (соотношение мужчин/женщин – 15/13) человек из 80, что составило 35,0% (рис.1).

Рис.1. Частота обнаружения мутаций у пациентов резистентных к терапии иматинибом в зависимости от фазы заболевания.

В группе пациентов находящихся в фазе акселерации мутации обнаружены у 14 (соотношение мужчин/женщин – 6/8) из 24 человек – 58,3%. Выявленные различия в частоте обнаружения мутаций в разных фазах заболевания статистически достоверны (p=0.0221). Различия по полу достоверными не являются (p=0.2585) (рис.1).

Среди 68 пациентов (38 мужчин и 30 женщин), не достигших к 18 месяцам полного цитогенетического ответа, что соответствует понятию первичной резистентности или рефрактерности, мутации обнаружены у 23 (13 мужчин и 10 женщин), что составляет 33,8% (рис.2).

Из 36 пациентов (18 мужчин и 18 женщин) с вторичной резистентностью, которым проведено аналогичное исследование, мутации выявлены у 19 (10 мужчин и 9 женщин) (52,8%). Выявленная разница в частоте встречаемости мутаций внутри группы резистентных больных ХМЛ статистически достоверна (p=0.0317). Различия по гендерному признаку не достоверны (p=0.4276).

Рис.2. Частота обнаружения мутаций киназного домена BCR-ABL в зависимости от типа резистентности к терапии иматинибом.

Среди пациентов с первичной резистентностью обнаружены 27 миссенс-мутаций, приводящие к заменам аминокислот в киназном домене ABLтирозинкиназы, которые являются причиной неэффективности терапии иматинибом согласно данным литературы (O’Hare T. et al., 2005): М244V/I (5), L248V (5), G250E (3), Q252E/L(2), Y253H(2), G255E/V (2), F311L (1), T315I (1), M351T(2), F359I (1), H396R (1), F401L (1), Y435C(1) (рис.3). В 6 случаях в опухолевых клетках обнаружены по 2 мутации гена BCR-ABL.

Проведенный анализ показал, что большая часть мутаций находятся в локусе, кодирующем P-петлю. Так, в этом участке обнаружено 19 (70,4%) мутаций из 27 (рис.3).

Рис.3. Схематическое изображение локализации и количества выявленных мутаций в областях гена BCR-ABL, кодирующих P-петлю (Р), иматиниб связывающий домен (IB), каталитический домен (С) и активационную петлю (А) киназного домена BCR-ABL тирозинкиназы у пациентов с первичной резистентностью.

В структуре ABL-тирозинкиназы имеются 2 гибкие петлевые структуры – АТФ-связывающая петля (P-петля) и активационная петля (А-петля). Данные регионы характеризуются специфичным, стабилизирующим структуру белка, пространственным расположением при неактивной конформации BCR-ABL. Иматиниб действует как конкурирующий ингибитор АТФ-связывающего домена, при этом взаимодействует с киназным доменом BCR-ABL киназы, образуя контакты минимум с 21 аминокислотой. Мутации в участке гена BCR-ABL, кодирующем Р - и А - петли, дестабилизируют их расположение так, что домен киназы не может перейти в неактивную пространственную организацию, необходимую для связывания с иматинибом.

Среди пациентов с вторичной резистентностью обнаружены 23 миссенс-мутаций, приводящие к заменам аминокислот в киназном домене ABL-тирозинкиназы, и 2 мутации сплайсинга, приводящие к делеции экзонов 4 и 7 ABL домена (рис. 4): G250E(6), Q252L (1), Y253H(2), E255V/K(2), L273M (1), F311L (1), T315I (2), M351T (1), F359V/I (5), H396R (2), delL184-K274 (1), delR362-A424 (1). Данные мутации согласно литературным данным являются причиной неэффективности терапии иматинибом O’Hare T., Walters D. K., Stoffregen E. P. et al., 2005). Анализ мутаций гена BCR-ABL у пациентов с ХМЛ, утративших большой или полный цитогенетический ответ, показал, что только 11 (47,8%) из 23 мутаций локализуются в локусе, кодирующем P-петлю (рис.4)

Рис.4. Схематическое изображение локализации и количества выявленных мутаций в областях гена BCR-ABL, кодирующих P-петлю (Р), иматиниб связывающий домен (IB), каталитический домен (С) и активационную петлю (А) киназного домена BCR-ABL тирозинкиназы у пациентов с вторичной резистентностью к иматинибу.

При исследовании динамики выявления мутаций у резистентных к терапии иматинибом пациентов с ХМЛ обнаружено увеличение доли пациентов с мутациями от 10% на 12 месяцев терапии до 32% после 6 лет терапии иматинибом (рис.5)

Для определения зависимости цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом от наличия обнаруженных мутаций киназного домена гена BCR-ABL рассчитаны показатели кумулятивной вероятности цитогенетического (БЦгО и ПЦгО) и молекулярного (БМО) ответов на терапию иматинибом.

12 18 24 36 48 Время (мес.)

Рис.5. Изменение частоты встречаемости мутаций гена BCR-ABL с течением времени при отсутствии эффекта в лечении ХМЛ иматинибом.

В группе больных ХМЛ без мутаций (n=62) кумулятивная вероятность достижения на 60 месяцев терапии БЦгО составила 88,6%, ПЦгО – 81,6%, БМО – 67,9% (рис. 6).

Рис. 6. Кумулятивная вероятность достижения а. БЦгО, ПЦгО и БМО в общей группе пациентов. б. БЦгО в группе пациентов с мутациями гена BCR-ABL. в. ПЦгО в группе пациентов с мутациями гена BCR-ABL. г. БМО в группе пациентов с мутациями гена BCR-ABL (n=42). Случаи без мутаций – синяя линия Пациенты с мутациями BCR-ABL – красная линия.

В группе пациентов, у которых при проведении молекулярно-генетических исследований обнаружены мутации киназного домена гена BCR-ABL, вероятность достижения БЦгО, ПЦгО и ПМО достоверно снижается: БЦгО на 60 месяцев терапии иматинибом составила 62,4% (p<0,0001) (рис.6б), ПЦгО – 22,6% (p<0,000001) (рис.6в), БМО – 5,9% (p<0,000001) (рис.6г). Интересно, что в группе больных ХМЛ с мутациями только у одного пациента достигнут БМО после 5 лет терапии иматинибом. У данного больного ХМЛ обнаружена мутация F311L после 24 месяцев терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки. Доза была повышена до 600мг/сут, а затем до 800мг/сут. В конечном итоге повышение дозы иматиниба позволило преодолеть резистентность и достичь БМО. У остальных пациентов (41 человек) снижения уровня экспрессии BCR-ABL ниже 0,1% (IS) не достигнуто.

Еще более убедительные данные о неблагоприятном влиянии мутаций киназного домена гена BCR-ABL получены при сравнении вероятности достижения ПЦгО и БМО в группах резистентных пациентов с мутациями и без мутаций. Оценка влияния мутаций на цитогенетический ответ в группе резистентных больных производилась на основе анализа вероятности достижения полного цитогенетического ответа, так как ПЦгО по нашему убеждению является более строгим критерием оценки эффективности терапии, чем большой цитогенетический ответ (БЦгО).

Анализ вероятности достижения ПЦгО в диапазоне от начала терапии до 24 месяцев лечения показал, что динамика достижения ПЦгО в группе резистентных пациентов с мутациями гена BCR-ABL достоверно не различается с динамикой ответа группы пациентов без мутаций (рис. 7а). При этом в обеих группах резистентных больных вероятность достижения ПЦгО достоверно ниже, нежели в группе пациентов с оптимальным ответом на терапию иматинибом. Далее, в период от 24 до 60 месяцев в группе резистентных пациентов без мутаций гена BCR-ABL вероятность достижения ПЦгО повышается и начинает достоверно отличаться от аналогичного показателя группы резистентных пациентов с мутациями гена BCR-ABL. При этом вероятность достижения ПЦгО не достигает таковой у пациентов контрольной группы (различие достоверно). И наконец после 5 лет терапии вероятность достижения полного цитогенетического ответа в группе резистентных пациентов без мутаций гена BCR-ABL приближается к таковой в группе больных ХМЛ с оптимальным ответом (различие становится статистически недостоверно). При этом вероятность достижения ПЦгО в группе пациентов с мутациями киназного домена гена BCR-ABL остается стабильно низкой.

Аналогичные особенности динамики наблюдались и в достижении большого молекулярного ответа. В течение первых 36 месяцев терапии иматинибом вероятность достижения БМО в группах резистентных пациентов без мутаций и с мутациями киназного домена гена BCR-ABL практически не различается, тогда как к 5 годам различие также становится значительным и статистически достоверным (рис. 7б). В данной ситуации особенно интересно, что резистентные пациенты без мутаций могут достигать БМО в более чем 50% случаев. Вероятность достижения БМО у пациентов с мутациями гена BCR-ABL в течение всего периода наблюдения остается минимальной.