Патологическая физиология системы крови (стр. 2 )

где А – число эритроцитов в пяти больших квадратах; b – степень разведения крови (1:200); В – количество маленьких квадратов в пяти больших (80); 4000 – 1/4000 объема счетной камеры над маленьким квадратом, мкл.

Для определения числа эритроцитов в 1 л крови (Х) используют формулу Х=А·10 (в десятой степени). Получают величину Т/л, где Т – тера, равна 10 в двенадцатой степени.

Определение количества гемоглобина. Наиболее точен гемоглобинцианидный колориметрический метод. Для анализа берут опытную, стандартную и контрольную пробы. Для подготовки опытной пробы к 5 мл трансформирующего раствора добавляют 20 мкл (0,02 мл) испытуемой крови, тщательно перемешивают и оставляют стоять в течение 10 мин. Затем колориметрируют при зеленом светофильтре (длина волны 500-560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольной пробы, в качестве которой берут трансформирующий раствор. Стандартная проба – это стандартный раствор гемоглобинцианида, ее исследуют в том же порядке, что и опытную пробу.

Количество гемоглобина (Нb, г на 100 мл) определяют по формуле

ЕопСК·0,001

Нb = ------------------ ,

Ест

где Еоп – оптическая плотность опытной пробы; Ест – оптическая плотность стандартной пробы; С – концентрация гемоглобинцианида в стандартном растворе (59,75 мг на 10 мл); 0,001 – коэффициент для пересчета мг в 1 г; К – коэффициент разведения крови (251).

Для установления количества гемоглобина в 1 л крови полученную цифру нужно умножить на 10.

Для определения количества гемоглобина в крови можно использовать метод Сали. Он менее точен, чем предыдущий, но прост в исполнении и широко распространен. Гемометр Сали (рис. 31) состоит из трех пробирок одного диаметра, помещенных в штатив, задняя стенка которого выполнена из стекла молочного цвета. Средняя пробирка пустая, она отградуирована и предназначена для исследуемой крови. Обе боковые пробирки запаяны и наполнены стандартным эталонным раствором, содержащим 167 г/л гемоглобина. К гемометру приложены капиллярная пипетка емкостью 20 мм³, пипетка для воды, стеклянная палочка для размешивания.

Принцип определения заключается в том, что под действием разведенной хлористоводородной (соляной) кислоты гемоглобин превращается в солянокислый гематин. Полученный раствор гематина разбавляют в градуированной (средней) пробирке дистиллированной водой до тех пор, пока его цвет не совпадет с цветом стандартных растворов. Количество гемоглобина устанавливают по уровню жидкости в градуированной пробирке в соответствии с имеющейся шкалой.

Для выполнения исследования в градуированную пробирку приливают 0,1 н. раствор хлористоводородной кислоты до метки 0. Из свежей капли крови кролика капиллярной пипеткой набирают 20 мкл. Оттуда кровь (без потерь) приливают к хлористоводородной кислоте в градуированной пробирке, тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Полученную гемолизированную кровь оставляют стоять в штативе гемометра на 5-10 мин до образования прозрачной бурой жидкости – соляно-кислого гематина. Дистиллированную воду капают до тех пор, пока цвет жидкости не сравняется с цветом стандартных растворов гемометра Сали. При этих условиях количество гемоглобина будет одинаковым в стандарте и в исследуемой крови. Отсчет ведут по нижнему мениску жидкости в градуированной пробирке, шкала которой показывает абсолютное содержание (г/100 мл) гемоглобина в исследуемой крови. Далее рассчитывают содержание гемоглобина в ммоль/л. Используют формулу

В·0,6206,

где В – количество гемоглобина (г/100 мл, г%), 0,6206 – коэффициент пересчета. Например, В=9 г%, тогда 9·0,6206=5,6 ммоль/л (по системе СИ).

Вычисление цветового показателя (ЦП). Для определения степени насыщенности эритроцитов гемоглобином используют формулу

Нb2Е1

ЦП = ----------- ,

Нb1Е2

где Hb1 – среднее количество гемоглобина в норме (г/л); Hb2 – количество гемоглобина у исследуемого животного (г/л); Е1 – среднее число эритроцитов в норме (1·10 в 12 степени/л); Е2 – среднее число эритроцитов у исследуемого животного (1·10 в 12 степени/л).

Вычисление среднего содержания гемоглобина в одном эритроците. Для определения этой величины используют данные о содержании эритроцитов и количестве гемоглобина в 1 мкл (1 л) крови. Для вычисления содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ), выраженного в пг (1 пг = 1 · 10 в -12 степени г), применяют формулу

Hb

СГЭ = ------- ,

Эр

где Hb – количество гемоглобина в 1 мкл (1 л) крови, пг; Эр – число эритроцитов в 1 мкл (1 л) крови.

Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) по методу Панченкова. Вычисляют скорость разделения цельной крови на плазму светло-желтой окраски и форменные элементы красной окраски за счет гемоглобина эритроцитов. Для определения берут градуированный стеклянный капилляр (от 0 до 100 мл), промывают его 5%-ным раствором лимоннокислого натрия. Набирают раствор до метки Р (высота 50 мм) и выпускают на часовое стекло. Из капли крови, взятой от кролика, в тот же капилляр дважды набирают кровь, до метки К и приливают ее к раствору лимоннокислого натрия в часовое стекло, тщательно перемешивая жидкости. Затем капилляр наполняют цитратной кровью и укрепляют в штативе в строго вертикальном положении (рис. 32). Результат оседания эритроцитов отмечают через час. Выражают СОЭ в мм/ч.

Таким образом, у контрольного и интактного кроликов определяют содержание в крови числа эритроцитов, количество гемоглобина, цветовой показатель, среднее содержание гемоглобина в одном эритроците, СОЭ. Используя полученные данные, составляют общую картину изменений красной крови при гемолитической анемии.

О ф о р м л е н и е п р о т о к о л а о п ы т а. Кратко описывают принципы определения показателей красной крови, использованные в эксперименте. Выполняют расчеты по рекомендованным формулам, фиксируют в протоколе. Полученные данные вносят в таблицу. Объясняют механизм изменений картины крови при гемолитической анемии.

О п ы т 2. Морфология эритроцитов у здоровых поросят и поросят-гипотрофиков.

М а т е р и а л ь н о е о с н а щ е н и е: микроскопы (15); термостаты (2); шлифованные стекла (30); предметные стекла (30); ножницы (2); пробирки (12); краска Романовского-Гимзы (100 мл); метиловый спирт (60 мл); гепарин (5000 ЕД в 1 мл) (1 мл); кедровое масло (10 мл); подопытные животные: здоровые поросята (6), поросята-гипотрофики (6).

П о с т а н о в к а о п ы т а. В день занятий берут кровь от шести здоровых поросят (5-недельного возраста) и шести поросят-гипотрофиков того же возраста, стабилизируют ее гепарином и используют для получения мазков с целью изучения морфологии эритроцитов. При этом учитывают, что поросята-гипотрофики с низким уровнем физиологической зрелости всегда страдают апластической анемией.

Из доставленных проб крови студенты изготавливают мазки. Для этого стеклянной палочкой каплю крови наносят на предметное стекло, отступив на 1-1,5 см от его узкого края. Пальцами левой руки удерживают стекло за длинные ребра. В правую руку берут шлифованное стекло, подводят его к капле и ждут, когда кровь равномерно распределится по шлифу. Затем быстрым движением шлифованного стекла справа налево покрывают предметное стекло тонким равномерным слоем крови (рис. 33). Для получения хорошего мазка предметное стекло должно быть достаточно обезжирено, слегка подогрето, шлиф должен равномерно касаться его поверхности, масса крови должна быть равномерно распределена, без перерывов и пустот. Полученный мазок высушивают на воздухе или в термостате (37ºС). Высушенный препарат погружают на 3-5 мин в метиловый спирт, окрашивают по Романовскому и вновь сушат.

Окрашенный мазок помещают под микроскоп для анализа элементов красной крови. Во время микроскопирования мазков обращают внимание на следующие изменения.

I. Наличие дегенеративных форм эритроцитов:

1)анизоцитоз характеризуется разной величиной элементов красной крови – наличием макро - и микроцитов;

2)пойкилоцитоз – изменения формы эритроцитов (звездчатые, овальные, грушевидные, серповидные);

3)анизохромия – появление слабоокрашенных (гипохромных) и сильноокрашенных (гиперхромных) эритроцитов;

4)эритроциты с кольцами Кебота;

5)эритроциты с тельцами Жолли.

II. Изменения количества клеток физиологической регенерации:

1)увеличение полихроматофильных эритроцитов (полихромазия – множественность цветовой окраски);

2)увеличение числа ретикулоцитов (специальная суправитальная окраска);

3)появление нормобластов (нормобластоз).

III. Наличие клеток патологической регенерации:

1)мегалобласты оксифильные;

2)мегалобласты полихроматофильные;

3)мегалоциты.

Результаты, полученные при анализе крови, взятой от разных животных (здоровых и гипотрофиков) несколькими студентами, обобщают и обсуждают.

О ф о р м л е н и е п р о т о к о л а о п ы т а. Кратко описывают способ получения и окраски мазка крови. Зарисовывают найденные патологические формы эритроцитов. Сопоставляют морфологическую картину элементов красной крови у здоровых поросят и поросят-гипотрофиков.

О п ы т 3. Моделирование гемолитической анемии паразитарного происхождения у крыс

М а т е р и а л ь н о е о с н а щ е н и е: операционные столики для крыс (2); хирургические наборы (2); большие стеклянные воронки (2); микроскопы (15); камеры Горяева (15); смесители для красной крови (15); гемометры Сали (15); микроцентрифуги электрические (2); аппараты Панченкова (2); эфир для наркоза (30 мл); 70%-ный раствор этилового спирта (30 мл); 1%-ный раствор натрия хлорида (70 мл); 0,1н. раствор хлористоводородной кислоты (15 мл); 5%-ный раствор лимоннокислого натрия (15 мл); подопытные животные: крысы (4).