Патологическая физиология системы крови (стр. 3 )

П о с т а н о в к а о п ы т а. За 7-10 дней до занятий студенты вместе с преподавателем проводят операцию по удалению селезенки у белой крысы. Для этого животное под эфирным наркозом фиксируют на столике брюшком вверх. Операцию проводят в стерильных условиях. Готовят операционное поле и по белой линии живота послойно рассекают брюшную стенку. Длина разреза не более 2 см. Через операционное отверстие проникают в брюшную полость, находят селезенку и осторожно извлекают ее, пользуясь анатомическим пинцетом. Перевязывают разволокненной шелковой нитью нервно-сосудистый пучок у основания органа, затем иссекают селезенку. На операционную рану послойно накладывают швы. Спленэктомированная крыса заболевает бартонеллезом. Бартонеллы внедряются в эритроциты, разрушают их. У животного на 7-10-й день после операции развивается гемолитическая анемия.

В день занятий для обследования берут здоровое животное (контрольное) и подопытное с гемолитической анемией. Кровь для гематологического анализа получают из кончика хвоста. Часть студентов подгруппы определяет содержание эритроцитов в крови, другие устанавливают количество гемоглобина, гематокритную величину, скорость оседания эритроцитов, цветовой показатель. Для изучения морфологических изменений элементов красной крови приготавливают мазки.

О ф о р м л е н и е п р о т о к о л а о п ы т а. Записывают условия проведения эксперимента и результаты собственных исследований. Объясняют патогенез гемолитической анемии паразитарного происхождения.

О п ы т 4. Состояние гемостаза у кроликов при мегалобластной анемии.

М а т е р и а л ь н о е о с н а щ е н и е: микроскопы (15); предметные стекла (15); покровные шлифованные стекла (15); стеклянные палочки (15); шприцы на 1 мл (2); пробирки (селиконированные или парафинированные) (4); лейкоцитарные смесители (15); камеры Горяева (15); чашки Петри (15); секундомеры (2); капиллярные трубки (15); пробирки (15); фильтровальная бумага (20); 1%-ный раствор оксалата аммония (10 мл); 14%-ный раствор сернокислой магнезии (10 мл); 0,1%-ный раствор акридина оранжевого (2мл); метиловый спирт (40 мл); 0,9%-ный раствор натрия хлорида (1,2 л); краска Майя-Грюнвальда (30 мл); краска Романовского (30 мл); дистиллированная вода (1,5 мл); 1%-ный раствор трилона Б (1 мл).

П о с т а н о в к а о п ы т а. Для изучения гемостаза берут двух взрослых однополых кроликов. Одному из них за пять дней до занятий ежедневно в ушную вену вводят раствор сапонина в возрастающей дозе, начиная с 1 мг и заканчивая 5 мг на 1 кг массы тела животного, растворяя его в 1 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида.

Кровь для исследований берут у интактного кролика и у кролика с экспериментальной мегалобластической анемией из сосудов уха. Изучают физико-химические свойства крови, используя различные тесты.

Существует более 20 способов подсчета кровяных пластинок, которые сводятся к определению их числа в окрашенном мазке в счетной камере и фазово-контрастной микроскопией.

Метод Фонио. Основан на предотвращении склеивания тромбоцитов добавлением к крови раствора сернокислой магнезии и подсчете их в окрашенном мазке.

Для выполнения анализа волосы на ухе кролика на участке против краевой вены тщательно выстригают, кожу протирают спиртом и эфиром. На обезжиренную сухую кожу наносят 1-2 капли 14%-ного раствора сернокислой магнезии. Для появления крови делают укол иглой через нанесенную жидкость. Обе жидкости перемешивают парафинированной палочкой и делают тонкий мазок на хорошо обезжиренном предметном стекле. Мазки высушивают на воздухе, окрашивают по Паппенгейму, для чего на нефиксированный мазок наносят неразведенный (фабричный) краситель Майя-Грюнвальда (2 мл), представляющий собой раствор эозина и метиленового синего в метиловом спирте. Спустя 3 мин к краске прибавляют 2 мл дистиллированной воды, смешивая их стеклянной палочкой или тонкой пипеткой. Через 1 мин, когда мазок приобретет розовый оттенок, краску сливают и, не высушивая, в течение 10-15 мин красят рабочим раствором краски Романовского, затем промывают дистиллированной водой и высушивают. Мазок изучают под иммерсионной системой микроскопа с помощью окуляра со счетным окошечком по Фонио. В каждом поле зрения считают сначала все эритроциты, а затем все тромбоциты. Передвигают препарат, меняя участки мазка до тех пор, пока не будет подсчитано 1000 эритроцитов и соответствующее количество кровяных пластинок. Исходя из общего числа эритроцитов в 1 л крови, с помощью составления пропорции рассчитывают количество тромбоцитов в том же объеме.

Подсчет тромбоцитов под люминесцентным микроскопом. Этим методом получают более четкие результаты. Согласно методике мазок, полученный по Фонио, после фиксации метиловым спиртом обрабатывают 3-4 мин раствором акридина оранжевого в разведении 1:1000 в изотоническом растворе натрия хлорида. Препарат покрывают покровным стеклом, избыток краски удаляют фильтровальной бумагой. Края покровного стекла заливают жидким парафином для предотвращения высыхания. В поле зрения подсчитывают число эритроцитов и тромбоцитов по методу Фонио.

В тромбоцитах различают периферическую беззернистую часть – гиаломер и внутреннюю – грануломер, который содержит азурофильную зернистость. Существуют четыре разновидности кровяных пластинок: юные тромбоциты, зрелые формы, старые и регенеративные формы. Последние не встречаются в обычных, физиологических, условиях. К ним относят гигантские пластинки, пластинки с большими отростками, очень мелкие пластинки, тромбоциты с очень крупной или пылевидной зернистостью. У здоровых кроликов число тромбоцитов составляет 125-250 Г/л (125-250·10 в девятой степени/л).

Определение тромбоцитов в счетной камере по методу Хауке. В шприц на 1 мл набирают 0,5 мл 1%-ного раствора трилона Б и 0,5 мл крови и быстро переносят в селиконированную (парафинированную) пробирку, где ее можно хранить в течение нескольких часов до анализа. Для подсчета набирают кровь из пробирки в лейкоцитарный меланжер (смеситель) до метки I, затем набирают 1%-ный раствор оксалата аммония до метки II. Жидкости смешивают и меланжер оставляют на 20 мин для гемолиза эритроцитов. После этого хорошо перемешивают содержимое смесителя в течение 2-3 мин, первые капли выпускают и заряжают счетную камеру. Так как тромбоциты оседают медленно, камеру ставят на 10 мин в чашку Петри с мокрой ваткой на дне. После этого подсчитывают тромбоциты в пяти больших (80 маленьких) квадратах. Для вычисления количества кровяных пластинок (Х) в 1 л пользуются формулой

Х = А · 10 в девятой степени,

где А – количество тромбоцитов, подсчитанное в пяти больших квадратах.

Определение времени кровотечения. Подготавливают участок уха кролика в его средней трети: тщательно выстригают волос, кожу обрабатывают сначала спиртом, потом эфиром, высушивают. Целостность кожи капилляров и вену на ограниченном участке нарушают стерильным копьем длиной 4 мм. С момента появления крови включают секундомер. Самопроизвольно выделяющуюся кровь снимают полосками фильтровальной бумаги через каждые 15-20 с, не прикасаясь ею к раневому отверстию. Секундомер останавливают тогда, когда окончательно прекращается вытекание крови. По времени, прошедшему от начала до окончания выхода крови, определяют время кровотечения. На этот показатель большое внимание количество тромбоцитов в крови и их качественная полноценность. Время кровотечения у здоровых кроликов составляет 2-4 мин.

Определение времени свертывания крови. Используют наиболее простой капиллярный метод по Шульцу. Капиллярную трубку диаметром 1 мм, длиной 15 см или специальный капилляр Шульца (рис. 34) подносят к выступающей капле и наполняют кровью. Кровь поднимается самотеком в силу капиллярности. Заполненный капилляр располагают таким образом, чтобы один конец был несколько выше другого. По секундомеру отмечают время начала анализа, т. е. момент заполнения капилляра кровью.

Через каждые последующие 30 с обрезают кусок капиллярной трубки длиной 1 см или отрезают одну бусинку капилляра Шульца и с помощью пинцета погружают в пробирку с изотоническим раствором натрия хлорида. При встряхивании пробирки первые пробы несвернувшейся крови смешиваются с жидкостью, окрашивая ее в красный цвет. Начало свертывания характеризуется более слабой окраской раствора, на дне пробирки обнаруживают свертки крови. О полном свертывании крови в капилляре свидетельствует отсутствие окраски изотонического раствора. Свернувшаяся кровь не вытекает из капиллярной трубки. Отмечают время конца свертывания.

Кроме состояния самой крови на скорость ее свертывания влияют также температура окружающей среды, количество крови, способы ее получения и определения, другие моменты. Поэтому в протоколе опыта необходимо очень точно указать условия эксперимента. У нормальных кроликов время свертывания крови составляет от 3 до 4,5 мин.

Определение относительной плотности крови и плазмы. Готовят серию растворов сульфата меди плотностью от 1,016 до 1,075. Для анализа используют как свежеполученную кровь, так и стабилизированную гепарином или трилоном Б. В пробирку с рабочим раствором глазной пипеткой с высоты 1 см опускают одну каплю крови или плазмы, которая погружается на глубину 2-3 см. Если относительная плотность капли больше плотности раствора – она тонет, если меньше – всплывает. Когда же относительная плотность крови или плазмы равна удельной плотности раствора, то капля остается во взвешенном состоянии, положение ее не меняется. Может быть и такое явление, когда в одном растворе капля всплывает, а в другом тонет, тогда относительную плотность устанавливают по среднему между ними показателю. Например, если при опускании капли крови в раствор с относительной плотностью 1,048 она всплывает, а в растворе с относительной плотностью 1,046 опускается на дно, то относительная плотность ее равна 1,047 кг/л.

Задание 3. В опытах на животных изучить изменения количественного и качественного состава лейкоцитов.

О п ы т 1. Моделирование лейкоцитоза у кролика.

М а т е р и а л ь н о е о с н а щ е н и е: клетки для кроликов (4); кюветы (4); микроскопы (15); смесители для лейкоцитов (15); камеры Горяева (15); шприцы на 5 мл с иглой (2); предметные стекла (26); жидкость Тюрка (28 мл); кипяченое молоко (5 мл); краска Романовского (50 мл); 0,9%-ный раствор натрия хлорида (10 мл); 70%-ный раствор этилового спирта (20 мл); кедровое масло (3 мл); подопытные животные: кролики (4).