Повышение жизнеспособности Yersinia pestis ЕV в биомассе вакцины (стр. 3 )

Таблица 2

Жизнеспособность вакцины чумной в зависимости от температуры выращивания после лиофилизации

Температура выращивания, °С	Количество определений	Концентрация микробных клеток
Общая, млрд./мл	Биологическая
%	млрд./мл
(21±1)	7	57,1±4,7	56,8±7,2	31,6±2,6
(27±1)	7	64,3±4,2	36,6±1,6	23,7±2,2
t	-	-	2,7	2,3

Выявлено, что экспериментальные серии, полученные при температуре выращивания (21±1) °С, проявили большую устойчивость к процессу замораживания-высушивания, чем контрольные. Расчет количества подкожных доз показал, что в опытном препарате их содержится 105, а в контрольном – 80.

Приготовленные экспериментально-производственные серии прошли контроль по всем показателям качества в НПЛ чумных вакцин и ЛБТК, а также в ФГУН ГИСК им. Роспотребнадзора, где данные серии признаны соответствующими всем требованиям ФСП на вакцину чумную.

Таким образом, как суспензия, так и вакцина, полученная при (21±1) °С культивирования, имеет преимущество по показателю жизнеспособности перед (27±1) °С контролем, при этом следует, очевидно, говорить о более выраженном периоде физиологической стабильности популяции (21±1) °С микробов.

Сравнительный анализ критериев качества различных
экспериментальных образцов вакцины чумной живой

Следующий этап исследований был направлен на изучение препарата вакцины чумной живой, полученного при сочетанном изменении физико-биологического (температура выращивания) и количественного (концентрация микробных клеток и объем в ампуле) параметров.

Для этого проводили выращивание вакцинного штамма на матрацах при температуре (21±1) °С – экспериментальные серии, и (27±1) °С – контрольные серии. Из полученной биомассы были приготовлены серии вакцины чумной живой, отличающиеся по концентрации вакцинной суспензии (90 и 20 млрд./мл) и объему вакцины в ампуле (2 и 1 мл соответственно). В полученных сериях определяли жизнеспособность, термостабильность, повреждаемость, потерю в массе при высушивании, реактогенность.

Анализ полученных данных вновь показал, что температура выращивания оказывает существенное влияние на показатели жизнеспособности препарата как до, так и после этапа лиофильного высушивания. Жизнеспособность препарата, выращенного при (21±1) °С, практически во всех образцах превосходит таковую у вакцины, выращенной при (27±1) °С не только после высушивания, но и при хранении в течение двух лет в условиях «холодовой цепи» при (4±2) °С (таблица 3).

При сравнительной характеристике жизнеспособности вакцинных образцов выявлено, что во все сроки хранения при температуре (4±2) °С данный показатель был выше у экспериментальных серий вакцины, при этом даже через два года он превышал 35 %, в отличие от контроля, где регистрировалась жизнеспособность ниже 25 %. Следует заметить, что у исследованных образцов экспериментальной (21±1) °С вакцины, приготовленной с уменьшением количественно-объемных показателей, во все сроки наблюдения разница в жизнеспособности была существенно выше, чем у (27±1) °С аналогов (р<0,05).

Таблица 3

Жизнеспособность различных серий вакцины чумной живой в процессе хранения при (4±2) °С, %

Температура выращивания, °С	оптическая концентрация 20 млрд./мл, объем в ампуле 1 мл	оптическая концентрация 80 млрд./мл, объем в ампуле 2 мл
после сушки	через 1 год	через 2 года	после сушки	через 1 год	через 2 года
(27±1)	26,8±3,0	24,3±0,8	24,2±1,2	28,1±0,9	24,4±1,2	24,1±1,6
(27±1)	30,8±2,6	30,2±0,3	25,0±1,3	30,6±3,1	25,2±1,6	24,7±3,4
М±m	28,8±2,0	27,3±3,0	24,6±0,4	29,4±1,3	24,8±0,4	24,4±0,3
(21±1)	35,2±2,6	32,4±1,2	30,1±2,4	36,1±1,7	34,3±0,6	29,3±3,6
(21±1)	49,2±7,3	43,6±3,9	39,8±0,8	53,4±4,8	44,5±2,2	42,9±1,3
(21±1)	43,8±4,8	40,2±0,5	36,6±2,2	-	-	-
(21±1)	37,7±3,5	35,8±1,9	29,1±1,2	-	-	-
(21±1)	38,4±3,0	38,1±1,6	35,2±0,7	-	-	-
(21±1)	46,1±2,0	45,0±4,1	40,9±1,8	-	-	-
М±m	41,7±2,2	39,2±1,9	35,3±2,0	44,8±8,7	39,4±5,1	36,1±6,8
t	4,3	3,4	5,2	1,8	2,9	1,7

Воздействие стрессового температурного фактора (хранение при (37±1) °С) на исследуемые образцы показало, что серии, полученные при температуре культивирования (21±1) °С, в целом обнаруживали большую резистентность к экстремальному воздействию, причем наиболее устойчивыми оказались образцы с меньшей концентрацией и объемом суспензии в ампуле, имеющие также меньшие показатели потери в массе при высушивании (1,7 % против 2,4 % у контрольных). Процент жизнеспособности через 30 сут составил у таких серий 7,8±3,3, а у контрольных образцов – 3,6±0,8 % (р<0,05).

Была определена термостабильность опытных и контрольных серий вакцины. Достоверной разницы не выявлено, хотя в целом показатели всех серий соответствуют регламентированной норме (не менее 4 сут).

С помощью электронной микроскопии определили степень повреждаемости микробных клеток исследуемых образцов. Наименьший достоверный показатель повреждаемости оказался у серий, полученных при сочетанном изменении температурных и количественно-объемных характеристик биомассы – 4,0±0,2 %, тогда как в контроле он составил 7,5±0,6 % (р<0,05).

Суммированные данные описанных качественных показателей различных образцов вакцины представлены в таблице 4.

Таким образом, вакцина, полученная из культивируемой при (21±1) °С биомассы, по своим свойствам превосходит коммерческие образцы, при этом оптимальное сочетание физико-биологического (температура культивирования) и количественно-объемного (концентрация и объем в ампуле) параметров дает наилучшие достоверные (р<0,05) результаты по основным показателям качества, таким как жизнеспособность и стабильность свойств при хранении.

Таблица 4

Сравнительная характеристика жизнеспособности, термостабильности и повреждаемости вакцин, полученных при различных условиях выращивания и с различным объемом суспензии в ампуле

Т выращивания, °С	Концент- рация, млрд./мл	Повреждаемость, %	Жизнеспособность, %	Термостабильность, сут
(21±1)	75	6,3±0,3	53,4±4,8	9,6
20	4,0±0,2	40,7±2,7	12,5
(27±1)	90	7,5±0,6	30,6±3,1	10,7
21	5,4±0,7	30,8±2,6	10,8

В полученных сериях вакцины чумной живой определяли реактогенность по совокупным данным пирогенности и специфической безопасности. Отклонений экспериментальных серий от контрольных не выявлено.

Изучение иммуногенности различных серий вакцины чумной
регламентированным методом и на модели феномена «переживания»

Помимо жизнеспособности, основной критерий живой вакцины – ее иммуногенность, то есть способность создавать длительный (до 1 года) и достаточный по напряженности иммунитет. Поскольку экспериментальные и контрольные серии были получены при сочетанном изменении температурного и количественно-объемного параметров, то нас интересовал их сопряженный иммунологический отклик.

Первоначально иммуногенные свойства экспериментальных и контрольных серий были изучены регламентированным двухэтапным методом на морских свинках и белых мышах (таблица 5).

Таблица 5

Иммуногенность вакцины чумной для белых мышей и морских свинок в зависимости от параметров суспензии

Температура выращивания, °С	Концентрация, млрд./мл	Объем в ампуле, мл	ED50, ж. м.к.
для морских свинок	для белых мышей
(27±1)	90	2	5852	4844
21	1	2601	7254
(21±1)	75	2	5206	9465
21	1	3468	5971

Эксперимент выявил, что как опытные, так и контрольные образцы имеют достаточно высокие защитные свойства, так как показатель ED50 во всех случаях имел допустимое значение.

Для более развернутой характеристики иммуногенных свойств экспериментальных и контрольных образцов были проведены исследования данного показателя на модели феномена «переживания» на белых мышах (таблица 6).