Повышение жизнеспособности Yersinia pestis ЕV в биомассе вакцины (стр. 1 )

На правах рукописи

АБЗАЕВА

Наталья Вячеславовна

ПОВЫШЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ

Yersinia pestis ЕV В БИОМАССЕ ВАКЦИНЫ

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ставрополь – 2010

Работа выполнена в

ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и

благополучия человека.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

;

доктор биологических наук

.

Ведущая организация: ФГУН «Государственный научный центр прикладной

микробиологии и биотехнологии».

Защита диссертации состоится «28» апреля 2010 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете , корпус 2, аудитория 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан «_____»__________________2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Живые вакцины представляют собой иммунопрофилактические препараты, состоящие из наследственно измененных форм возбудителей инфекционных болезней. Применение вакцинации как средства специфической профилактики особо опасных инфекций в течение длительного времени свидетельствует о сохранении ее весомой роли в системе противоэпидемических мероприятий (, , 2004). В нашей стране для профилактики чумной инфекции используют живую вакцину из штамма Yersinia pestis ЕV.

Стабилизация качества препарата, а именно необходимость сохранения всех свойств микробных клеток в течение длительного времени, является наиболее значимым вопросом в производстве живых вакцин. Последнее время в орбите научных интересов, касающихся совершенствования биотехнологии производства вакцины чумной живой, оказались методические приемы, направленные на дальнейшую стандартизацию коммерческого препарата по показателю жизнеспособности клеток Y. pestis ЕV (, 1988; , 2002; , 2005). Современная тактика совершенствования вакцины чумной направлена на разработку и внедрение в производство дополнительных условий стабилизации числа живых микробных клеток в прививочной дозе коммерческой вакцины.

В результате ранее проведенных исследований была разработана производственная биотехнология вакцины чумной живой с содержанием от 20 до 50 доз в амп5). Полученный с нашим участием по новой биотехнологии препарат соответствует требованиям, предъявляемым к вакцине чумной живой, и включен в действующий промышленный регламент № 000-09-09 на производство вакцины чумной живой.

Имеющиеся литературные данные (, 1974) дают основание предполагать, что снижение температуры культивирования чумного микроба до 20-25 °С может значительно улучшить качество вакцины за счет возрастания в биомассе процента живых клеток, так как здесь температурный фактор определяет соответствующий уровень физиологической и метаболической активности микробных клеток. Вышеизложенное послужило основанием для апробации режимов культивирования вакцинного штамма при температуре (21±1) °С вместо регламентированных в ПР на вакцину чумную (27±1) °С, что способствовало большей устойчивости к лиофилизации на одноименном этапе производства препарата вакцины (коррекция биологических параметров) (, , и др., 1993; , , и др., 1994; , , и др., 1997; , , 1998; , , и др., 1998).

Полученные результаты определяют целесообразность и перспективность доработки и внедрения пониженной температуры культивирования биомассы (21±1) °С в процесс производства вакцины чумной живой. Кроме того, приведенные сведения являются достаточным экспериментально-теоретическим обоснованием для отработки и внедрения в биотехнологию вакцины чумной живой сочетанного воздействия обоих указанных выше факторов: физико-биологического и количественно-объемного.

Отработка и внедрение в биотехнологию выращивания биомассы препарата вакцины чумной живой пониженной температуры культивирования, а также сочетание с оптимизацией ее параметров на этапах сведения и розлива, позволивших повысить исходную жизнеспособность и стабилизировать число живых микробных клеток в прививочной дозе, определяют актуальность данной работы.

Цель исследования: Повысить показатель жизнеспособности микробных клеток и стабилизировать их число в прививочной дозе вакцины чумной.

Задачи исследования:

1. Экспериментально обосновать целесообразность корректировки температурных условий культивирования вакцинной суспензии в биотехнологии вакцины чумной живой.

2. Изучить в эксперименте сравнительные показатели жизнеспособности и повреждаемости микробных клеток в различных сочетаниях температурных и количественных характеристик биомассы.

3. Изучить основные показатели качества препарата вакцины чумной живой, полученной в условиях оптимальной сочетанной корректировки количественных и температурных параметров вакцинной суспензии.

4. Стабилизировать число живых микробных клеток в препарате вакцины в процессе хранения за счет оптимизации температурных и количественных показателей микробной биомассы.

5. Изучить иммуногенность и напряженность иммунитета, индуцируемого вакциной чумной, полученной из микробных клеток при предлагаемых условиях приготовления суспензии. Определить бактерицидную активность полиморфноядерных лейкоцитов в периферической крови белых мышей при инфекционных и вакцинных процессах в качестве косвенных показателей их иммунологической перестройки.

Научная новизна работы. Впервые разработаны и внедрены температурные режимы культивирования вакцинной биомассы в градиенте (21±1) °С, вместо регламентированных (27±1) °С, что позволяет получить более высокий исходный показатель живых микробных клеток как в биомассе, так и в вакцине, полученной из нее.

Впервые предложен и реализован научно-методический подход к повышению жизнеспособности микробных клеток Y. pestis ЕV в вакцинной суспензии за счет сочетанного применения оптимальных температурного (21±1) °С и количественно-объемного ((1-4)×1010 микробных клеток в объеме 1 мл в ампуле) параметров в биотехнологии производства вакцины чумной живой. Показано, что в условиях регламентированного режима лиофилизации повышается эффективность стабилизации свойств микробных клеток у препарата с меньшей концентрацией вакцинной суспензии и снижением ее объема в ампуле, особенно у образцов со сниженной температурой культивирования (21±1) °С. Впервые показано, что устойчивость к чуме у белых мышей коррелирует с защитной функцией полиморфноядерных лейкоцитов крови (ПМЯЛ), обеспечиваемой главным образом кислородзависимой миелопероксидазой (МПО) при вспомогательном участии кислороднезависимых неферментных катионных белков (КБ). Изменение уровня активности МПО и КБ ПМЯЛ может служить косвенным показателем степени устойчивости белых мышей к чумной инфекции.

Теоретическая и практическая значимость работы. Отработан диапазон пониженной температуры культивирования микробной биомассы вакцины чумной живой (21±1) °С вместо регламентированного (27±1) °С, позволяющий увеличить число живых микробных клеток в готовом препарате на 12-20 % и стабилизировать его в процессе хранения.

Вакцина чумная живая, полученная по предложенной схеме, прошла контроль в лаборатории препаратов против чумы и других особо опасных инфекций ФГУН ГИСК им. Роспотребнадзора, из которого получено положительное заключение.

Доказано, что сочетанное изменение температурного и количественно-объемного параметров при получении вакцины обеспечивает наилучшие показатели качества готового препарата, в частности его жизнеспособности.

Практическая ценность работы подтверждена следующими документами:

1. Изменения № 1 к Промышленному регламенту № 000-01-04 предусматривают выпуск вакцины со сниженным количеством доз в производственной упаковке.

2. Методические рекомендации «Определение иммуногенности вакцины чумной живой в модели феномена «переживания» на белых мышах», утверждены директором ФГУЗ Ставропольского НИПЧИ Роспотребнадзора (протокол заседания Ученого Совета института от 16 апреля 2009 г. № 4).

3. Изменения № 1 к Промышленному регламенту № 000-09-09, предусматривающие выпуск вакцины как при температуре культивирования (27±1) °С, так и при (21±1) °С, утверждены в ФГУН ГИСК им. Роспотребнадзора 22.12.2009 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Пониженная температура культивирования биомассы Y. pestis EV стимулирует биологическую активность микробных клеток, что позволяет увеличить количество живых микробных клеток в вакцине.

2. Полученный при пониженной температуре культивирования препарат соответствует требованиям, предъявляемым к вакцине чумной живой, и предназначен как для планового практического применения, так и для массовых иммунизаций.

3. Сочетанное изменение температурных и количественно-объемных параметров вакцинной суспензии позволяет достичь наиболее высоких показателей качества в готовом препарате вакцины чумной живой, особенно жизнеспособности и стабилизации свойств при хранении, что сопряжено с более низким показателем повреждаемости микробных клеток.

4. Иммуногенные свойства полученных образцов вакцины, изученные как двухэтапным методом, так и в модели феномена «переживания», соответствуют регламентированным нормам.