Повышение жизнеспособности Yersinia pestis ЕV в биомассе вакцины (стр. 2 )

5. Цитоэнзимохимические показатели полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови у белых мышей отражают степень ответной реакции организма экспериментальных животных на введение инфекционного и вакцинного агентов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы», посвященном 80-летию Санкт-Петербургского института им. Пастера (Санкт-Петербург, 3-5 сентября, 2003); межгосударственной научно-практической конференции государств–участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (Оболенск, 3-5 октября, 2006); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 21-22 марта, 2007); научно-практической конференции «Основные итоги научно-практической деятельности молодых ученых и специалистов СтавНИПЧИ» (Ставрополь, 9 июня, 2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля, 2009); научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 14-15 мая, 2009).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках двух государственных тем НИР «Стабилизация показателя живых микробных клеток в чумной вакцине за счет оптимизации некоторых количественных параметров на этапах приготовления коммерческого препарата» (№ Госрегистрации 01200109089); «Разработка научно-методических подходов к повышению жизнеспособности микробных клеток штамма ЕВ чумного микроба в вакцинной суспензии в биотехнологии приготовления вакцины чумной живой сухой» (№ Госрегистрации 01200700918), отражено в 12 опубликованных научных работах, в том числе две работы – в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы; иллюстрирована 26 таблицами и 7 рисунками. Список литературы включает 206 источников, из них 175 – отечественных и 31 – зарубежный.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Материалом для выполнения экспериментальной части работы служили 3 коммерческие, 6 экспериментально-производственных и 12 экспериментальных серий вакцины чумной живой из штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, приготовленные в научно-производственной лаборатории чумных вакцин ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.

Для заражения лабораторных животных использовали вирулентный штамм Y. pestis 461, полученный из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.

Все питательные среды и среды высушивания, использованные в работе, получены из лаборатории питательных сред для культивирования микроорганизмов I-IV групп патогенности ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.

В опытах были использованы: 402 беспородные белые мыши массой 18–20 г, 340 морских свинок массой 250-300 г, 12 кроликов массой 1,5-2,5 кг.

Критерии качества препарата вакцины чумной живой определяли в соответствии с ФСП 42-8654-07.

В инкубируемых бульонных культурах высчитывали длительность периодов роста, число клеточных делений и время одной генерации (Дж. Мейнелл, Э. Мейнелл, 1967; Г. Шлегель, 1987).

Повреждаемость микробных клеток в процессе экспериментальной отработки препарата вакцины оценивали с помощью электронно-микроскопического метода. Жизнеспособность микробов в вакцинах определяли культуральным методом по ФСП 42-8654-07. Оптическую концентрацию находили в соответствии с «Инструкцией по применению отраслевого стандартного образца (ОСО 42-28-85П) для визуального определения мутности бактериальных взвесей, стеклянного», 10 МЕ которого эквивалентны 1×109 м. к. чумного микроба.

Иммуногенность всех образцов вакцины чумной живой определяли в соответствии с методикой, изложенной в действующей ФСП на вакцину чумную. Иммуногенность вакцинных препаратов в феномене «переживания» изучали в соответствии с «Методическими рекомендациями по определению степени иммуногенности авирулентных штаммов чумного микроба для белых мышей» (1984), используя нелинейных белых мышей.

Динамику кислород-зависимой бактерицидной системы определяли по активности миелопероксидазы (МПО), кислород-независимой системы – по уровню катионных белков (КБ) ПМЯЛ крови у белых мышей после иммунизации и в инфекционных процессах различной модификации с помощью цитоэнзимохимических методов (, 1973; , 1978).

Пирогенные свойства готового препарата вакцины чумной изучали по методике, описанной в XII Государственной фармакопее (2008), на кроликах массой 1,5-2,5 кг.

Показатель термостабильности вакцины рассчитывали в соответствии с ФСП 42-8654-07.

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы «МИНИСТАТ», которая позволяет определить среднее значение (M), среднеквадратическую ошибку (m) при заданных значениях уровня и количестве степеней свободы.

Результаты исследований

Выращивание популяции клеток вакцинного штамма Y. pestis EV
при температуре культивирования (21±1) ºС.

Первый этап наших исследований был направлен на совершенствование вакцинного сырья в условиях измененного температурного режима культивирования микробов – снижения его до (21±1) °С (экспериментальная линия) вместо (27±1) °С (контроль), для чего выращивали штамм Y. pestis EV в бульоне Хоттингера при обеих температурах. В рядах проводили сравнительную характеристику микробной популяции, для чего определяли количество живых микробных клеток в различные сроки исследования (накопление биомассы) и число клеточных делений в каждый из исследуемых сроков, что позволило рассчитать время одной генерации. Эксперимент выявил, что хотя микробы биомассы, культивируемой при (21±1) °С, имеют более длительную фазу приспособления, чем при (27±1) °С варианты (9 ч и 6 ч соответственно), однако в логарифмической фазе роста максимальное количество жизнеспособных особей в эксперименте достигает 954,5±9,1 млн. против 112,0±0,4 млн. в контрольной линии (t=92,9). Через 48 часов (срок наблюдения) число живых микробных клеток в контроле опускается до 88,0±1,0 млн., а в эксперименте – до 155,0±5,8 млн. (t=11,4). Следовательно, абсолютные показатели живых клеток в сравниваемых образцах выше в биомассе с температурой культивирования (21±1) °С (таблица 1).

Таким образом, в условиях культивирования микробных клеток вакцинного штамма Y. pestis EV при температуре (21±1) °С в бульоне Хоттингера получена гораздо более жизнеспособная популяция, чем при (27±1) °С выращивании, исключая период адаптации (6-9 ч). Полученные результаты определили дальнейшие исследования, которые коснулись как получения большего числа живых особей при выращивании на плотной питательной среде, так и оценки устойчивости их к процессу замораживания – высушивания и последующему хранению. Для этого исследовали биомассы и полученные из них вакцины – опытные серии ((21±1) °С) и контроль ((27±1) °С).

Через 48 час выращивания при обеих температурах накапливалось примерно одинаковое количество биомассы, при этом «урожай» с 1 мл питательной среды составлял не менее 4 млрд. м. к. Однако биологическая концентрация оказалась статистически выше (р<0,05) в сериях, выращиваемых при (21±1) °С. Так, процент живых микробных клеток через 48 ч составил 86,3±3,5 % у экспериментальных линий, и 57,3±3,9 % – у контроля, а их количество в суспензии – 140,6±20,0 млрд./мл в опыте и 92,0±10,2 млрд./мл в контроле. Далее из обеих суспензий были приготовлены экспериментально-производственные серии вакцины чумной живой. После лиофилизации вновь проверили показатели жизнеспособности (таблица 2).

Таблица 1

Накопление биомассы Y. pestis EV при различных температурных режимах культивирования

Темпера-тура выращи-вания, °С	Количество живых микробных клеток (млн./мл) в зависимости от возраста культуры (ч)
ис-ход-ное	3	6	9	12	15	18	21	24	27	30	33	36	39	42	45	48
(21±1)	1,03	1,03± 0,3	1,9 ±0,2	3,4 ±0,3	58,4 ±3,0	753,0 ± 46,7	954,5 ± 9,1	742,5 ± 12,3	856,3 ± 28,4	81,9 ± 6,6	186,3 ± 25,7	140,5 ± 2,6	175,8 ± 9,6	160,3 ± 6,0	186,3 ± 17,9	180,0± 19,9	155,0± 5,8
(27±1)	1,03	1,4 ±0,1	4,4 ±0,4	19,6±0,3	126,3± 6,7	104,3 ±8,5	112,0 ±0,4	99,8 ±1,7	93,3 ±0,9	113,0±11,2	106,5 ±6,5	129,3±7,1	142,5±5,8	130,3±13,6	132,5±9,8	112,0±11,6	88,0 ±1,0
t	-	0,3	5,6	38,6	9,3	13,7	92,9	51,8	26,9	2,4	3,0	1,5	3,0	2,0	2,6	3,0	11,4

Примечание: t – степень достоверности различия средних арифметических