Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов (стр. 2 )

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи в рецензируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование свойств НК в конденсированных средах

Основой многих сенсорных систем для многопараметрического анализа многих объектов, являются упорядоченные 2-х (планарные микрочипы) или 3-х мерные структуры (жидкие чипы на основе коллоидных спектрально кодированных микрочастиц). При создании таких систем на основе полупроводниковых CdSe/ZnS нанокристаллов в обоих случаях важно понимание - как изменяются свойства НК в конденсированных средах.

Для изучения свойств НК в конденсированных средах была разработана методика формирования пленок из НК на твердой подложке (оптические стекла). Были сформированы (1) пленки с предельно высокой концентрацией НК со средним расстоянием между НК ~ 4 нм, что соответствует плотной гексагональной упаковке НК, покрытых монослоем ТОФО и объемной концентрации 1.5*1019 см-3 и (2) пленки, представляющие собой НК, распределенные в матрице ТОФО со средним расстоянием 9 нм, что соответствует объемной концентрации 1.3*1018 см-3. Измерения среднего расстояния между НК осуществляли методом АСМ.

Рис. 1. Спектры поглощения (сплошная) и флуоресценции (пунктир) раствора и пленок CdSe/ZnS НК диаметром 4 нм.

(1) Раствор НК гексане.

(2) Пленка с "низкой" плотностью НК (объемная концентрация 1.3*1018 см-3).

(3) Пленка с "высокой" плотностью НК (концентрация 1.5*1019 см-3).

Точечной линией показана длина волны возбуждающего излучения. Толщина пленок - 100 монослоев.

Спектры поглощения и флуоресценции пленок НК размером 4 нм представлены на Рис.1, 2. Видно, что для пленок с высокой концентрацией НК спектры поглощения и флуоресценции испытывают сильный сдвиг в красную область по сравнению с дисперсией НК и пленками с низкой концентрацией НК, что свидетельствует о достаточно сильном взаимодействии между НК и, как следствие, о смещении положения максимума флуоресценции пленок НК. Было обнаружено, что по мере увеличения плотности пленки положение максимума спектра флуоресценции сдвигается в красную область, при этом ширина пика флуоресценции и поглощения практически не зависит от толщины пленки. Таким образом, данные результаты показывают, что даже при минимальном расстоянии между НК в формируемых пленках наблюдается эффект размерного квантования. При этом параметры флуоресценции и поглощения поверхностных конденсатов НК определяются расстояниями между НК.

Сравнение флуоресценции пленок НК и красителей родаминового ряда показало, что в конденсированной фазе квантовый выход флуоресценции НК на два порядка превосходит квантовый выход флуоресценции красителя (Рис. 2).

Далее было исследовано влияние плотности мощности возбуждающего излучения на интенсивность флуоресценции пленок с предельно высокой концентрацией НК методом лазерной индуцированной люминесценции. На Рис. 3 представлена зависимость интенсивности флуоресценции от плотности возбуждающего излучения. Как видно, положение максимумов и полуширины спектров флуоресценции пленок не меняются при увеличении плотности потока лазерного излучения до 1×106 Вт/см2. При высокой плотности возбуждения квантовый выход сильно падает, однако флуоресценция сохраняется. Важно отметить, что мощности возбуждения порядка 1×103 предельны для органических красителей. Таким образом, полностью возможности флуоресцентных проб на основе полупроводниковых НК могут быть реализованы при использовании высоких плотностей мощности. В этом случае можно ожидать повышения чувствительности аналитических устройств, по крайней мере, на 3 порядка.

Рис. 2 Сравнение флуоресценции НК (CdSe/ZnS диаметром 4 нм) и флуоресценции ацетата родамина 6Ж: (а) - растворы НК и Р6Ж, (б) - пленки. Возбуждение - 532 нм, плотность мощности возбуждения - 4*103 Вт/см2.

Рис. 3 Спектры флуоресценции пленки с высокой концентрацией НК диаметром 4 нм. Толщина пленки 100 нм. Возбуждение флуоресценции лазерным излучением с λ = 523 нм с различными плотностями потока.

Полученные результаты дают оценку оптимальной плотности НК в конденсированном состоянии: средние расстояния не должны быть меньше 2 диаметров НК, иначе они влияют друг на друга, что приводит к ухудшению оптических свойств НК (красное смещение, существенное снижение квантового выхода). Поэтому, для последующего включения в полимерную матрицу мы подбирали концентрации НК таким образом, чтобы красного смещения не происходило.

2. Получение водных дисперсий НК путем модификации НК природными и синтетическими полимерами

Для того, чтобы флуоресцентные наноразмерные частицы могли быть использованы в качестве флуоресцентных биомареров в in vitro и in vivo анализах для визуализации клеток, кодирования ДНК, направленной доставки наночастиц в клетки и т. д., они должны характеризоваться высокой коллоидной устойчивостью, малыми размерами частиц – до 100 нм, а также наличием функциональных групп на поверхности для визуализации образования комплекса «лиганд – антилиганд». Решение указанных задач и рассматривается данном разделе работы.

2.1 Модификация НК посредством замещения ТОФО бифункциональными лигандами с последующим формированием защитного слоя

Данный способ модификации основан на образовании дисульфидной связи между атомами, входящими в состав оболочки ZnS и меркаптогруппой тиолсодержащих соединений путем замещения стабилизирующего лиганда ТОФО на поверхности НК и последующим формированием дополнительного защитного полимерного слоя.

а

Рис. 4 (а) Интенсивность флуоресценции НК (диаметр 4 нм), НК, модифицированных цистеином (Цис-НК) и смесью меркаптоуксусная кислота/меркаптоэтанол (МУК-НК). (б) Распределение частиц по размерам для НК, модифицированных цистеином.

Изначально нами были реализованы и усовершенствованы известные методики по модификации НК с помощью цистеина и меркаптоуксусной кислоты. Исходные гидрофобные НК модифицировали тиолсодержащими молекулами, в частности цистеином и смесью меркаптоэтанол/меркаптоуксусная кислота (мольное соотношение 1/1). Полученные гидрофилизированные НК характеризовались средними размерами частиц 5 и 8 нм соответственно, то есть практически сохранялись размеры исходных частиц, что свидетельствует о модификации индивидуальных НК, а также высокой интенсивностью флуоресценции (рис. 4 а), однако в водном растворе сохраняли коллоидную устойчивость не более 1 месяца. Причиной снижения коллоидной устойчивости является, вероятно, динамический характер связи (Zn-S, S-S) бифункционального лиганда с поверхностью НК. Можно предположить, что солюбилизирующий лиганд постепенно переходит в водную среду, приводя к агрегации модифицированных НК. При этом ионы кадмия, входящие в состав ядра НК, также могут переходить в раствор и контактировать с окружением НК, что ограничивает их биосовместимость. Следует отметить, что модификация НК тиолсодержащими молекулами приводит к уменьшению квантового выхода более чем на 10% и красное смещение максимума флуоресценции составляет 5 - 10 нм (рис. 4 а).

С целью увеличения коллоидной устойчивости и повышения биосовместимости была разработана методика формирования дополнительного защитного слоя посредством образования ковалентных связей или электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными карбоксильными группами гидрофилизированных НК и аминогруппами биомолекул или катионных ПАВ. В настоящей работе использовали полипептид поли-L-лизин, полисахариды (хитозан), а также синтетический поликатион полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПДАДМАХ). Образование дополнительного полимерного слоя контролировали методом ИК-спектроскопии. Такая способ дополнительной модификации гидрофилизированных НК привел к увеличению коллоидной устойчивости (частицы сохраняли стабильность в течение как минимум 2 месяцев) и интенсивности флуоресценции (Рис. 5, 6), однако размер частиц заметно увеличился - до 20 – 80 нм по сравнению с гидрофилизированными НК, что указывает на образование устойчивых кластеров гидрофилизированных НК.

Рис. 5 Интенсивность флуоресценции и положение максимума флуоресценции исходных НК (1), Цис - НК (2), Цис-НК, модифицированных хитозаном (3), поли-L-лизином (4), ПДАДМАХ (5).

Рис. 6 Сравнение и стабильность во времени квантового выхода Цис-НК, Цис-НК, модифицированных хитозаном и поли-L-лизином.

2.2 Модификация НК амфифильными полимерами

Данный способ модификации НК основан на использовании гидрофобных взаимодействий между октильными лигандами ТОФО на поверхности НК и гидрофобными группами амфифильных полимеров. Такой способ позволяет защитить и гидрофилизовать поверхность НК за счет гидрофильных групп амфифильных полимеров, не удаляя ТОФО с поверхности частиц. В отдельных случаях для создания более прочной и стабильной оболочки необходима дополнительная сшивка макромолекул в поверхностном слое диаминами.

В настоящей работе использовали следующие амфифильные полимеры: полиакриламидный конъюгат, содержащий 15% мол. β-галактозы и 10% мол. диолеоилфосфатидилэтаноламина (PHEAA-Galβ(15%)-DOPE(10%)), чередующийся сополимер малеинового ангидрида и 1- тетрадецена (СМТ) и моногидрокси(1-меркаптоундецил)тетраэтиленгликоль (МГМТГ).

При модификации НК PHEAA-Galβ(15%)-DOPE(10%) и СМТ были получены стабильные дисперсии НК, сохраняющие коллоидную устойчивость в водных средах в течение 3 месяцев, однако диаметр частиц также оказался несколько выше диаметра исходных НК, что свидетельствует об образовании кластеров НК.