Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов (стр. 3 )

Как видно из рис. 7, квантовый выход НК, модифицированных PHEAA-Galβ(15%)-DOPE(10%) и СМТ значительно увеличился по сравнению с исходными гидрофобными НК. На основании проведенных экспериментов по гидрофилизации НК было установлено, что прирост квантового выхода сильно зависит от качества НК: относительное увеличение квантового выхода тем больше, чем меньше абсолютное значение квантового выхода исходных НК.

Другой перспективный вариант реализации данного способа модификации НК состоит в использовании МГМТГ, имеющего в составе меркаптогруппу, обеспечивающую связывание с оболочкой НК, гидрофобный фрагмент, имеющий сродство к оболочке НК и облегчающий проникновение меркаптогруппы к поверхности НК, а также гидроксильную группу для коллоидной стабилизации частиц в водных средах и последующего связывания биолигандов.

НК, модифицированные МГМТГ, характеризовались высокой коллоидной устойчивостью в водных растворах и малым размером частиц – 9±1 нм, при этом квантовый выход увеличился в 3 раза по сравнению с исходными гидрофобными НК (рис.7). Также стоит отметить, что данные дисперсии сохраняют свою коллоидную устойчивость в водной среде уже более года с сохранением флуоресцентных характеристик.

Г

Рис. 7 Сравнение квантового выхода и стабильности во времени исходных НК в гексане, Цис-НК и НК, модифицированных СМТ, конъюгатом PHEAA-Galβ(15%)-DOPE(10%) и МГМТГ.

Как было отмечено выше, модификация НК тиолсодержащими функциональными молекулами приводит к уменьшению квантового выхода более чем на 10%, при этом красное смещение максимума флуоресценции составляет 5-10 нм. В случае модификации НК амфифильными полимерами (без удаления стабилизирующего лиганда ТОФО с поверхности НК) смещения максимума флуоресценции не происходит.

Таким образом, были получены стабильные флуоресцентные частицы методом модификации НК цистеином и смесью меркаптоэтанол/меркаптоуксусная кислота с последующим формированием дополнительного полимерного защитного слоя (хитозан, поли-L-лизин, ПДАДМАХ), характеризующиеся высокими флуоресцентными свойствами. Использование полимеров с целью дополнительной стабилизации НК приводит к некоторому укрупнению частиц, но в то же время к увеличению коллоидной устойчивости и квантового выхода водных дисперсий НК. Однако лучшие результаты по коллоидной стабильности и увеличению квантового выхода демонстрируют НК (кластеры НК), модифицированные амфифильными полимерами (PHEAA-Galβ(15%)-DOPE(10%), СМТ, МГМТГ.

Перечень разработанных типов флуоресцентных наноразмерных частиц и их характеристики приведены в сводной таблице 1. НК, модифицированные цистеином, были апробированы для иммунофлуоресцентного мечения клеток, а также в качестве контрастирующих агентов в методе флуоресцентной оптической томографии.

Таблица 1. Характеристики наноразмерных флуоресцентных частиц

№	Модифицирующий агент	Функциональные группы на поверхности модифицированных НК	Средний диаметр частиц, нм
1.1	Цистеин	NH2, COOH	5
1.2	Меркаптоэтанол/меркаптоуксусная кислота	OH, COOH	8
1.3	Поли-L-лизин гидробромид, (ММ 15000-30000)	NH2, COOH	65
1.4	Хитозан	NH2	76
1.5	ПДАДМАХ	-	24
1.6	Galβ(15%)- PHEAA - DOPE(10%)	OH	68
1.7	Сополимер малеинового ангидрида и 1- тетрадецена (после гидролиза)	СООН	44
1.8	моногидрокси(1-меркаптоундецил)тетраэтиленгликоль	OH	9

3. Инкапсулирование НК в частицы полимерных дисперсий

Следующий вариант модификации заключался во включении гидрофобных НК в частицы полимерных дисперсий, которые нашли широкое применение в качестве носителей биолигандов в различных видах биоанализа. Использование флуоресцентных меток, которые выполняют индикаторную функцию, позволяет визуализировать появление биоспецифических комплексов, что значительно упрощает проведение анализа. Однако, использование традиционных органических красителей в качестве флуоресцентных меток, сопровождается трудоемким процессом подбора условий эффективного введения красителя и получения интенсивного сигнала флуоресценции (подбор природы полимерной матрицы, способа введения, концентрационных зависимостей и т. д.), а также осложняется диффузией красителя из полимерной матрицы в процессе хранения. Кроме того, использование многоцветных оптически кодированных органическими красителями полимерных микрочастиц осложняется сложностью их анализа, требующего несколько источников возбуждения с разными длинами волн. Все вышеуказанное снижает эффективность использования органических красителей в качестве флуоресцентных меток в полимерных дисперсиях.

Таким образом, разработка единообразных подходов к формированию флуоресцентных субмикронных полимерных дисперсий с заданным в зависимости от области применения диапазоном диаметров, узким распределением частиц по размерам (РЧР), наличием функциональных групп на поверхности для образования прочной связи с биолигандами, высокой фотостабильностью, сохраняющих коллоидную устойчивость в широком диапазоне рН и в физиологических средах, а также позволяющих реализовать многопараметрические методы анализа с использованием многоцветного флуоресцентного кодирования, является весьма перспективной задачей.

3.1 Включение НК в полимерную матрицу на основе акролеина

Анализ литературных данных и проведенные исследования показали, что перспективными для биоанализа являются полимерные микросферы на основе акролеина, принципиальным достоинством которых является наличие на их поверхности альдегидных групп, позволяющих в мягких условиях присоединять к их поверхности биологические молекулы.

В зависимости от способа полимеризации и сополимеризации акролеина в водных средах могут быть получены полимерные дисперсии в широком диапазоне диаметров – от 100 до 1,5 мкм с узким РЧР при сохранении коллоидной стабильности. Наличие поверхностных альдегидных групп для прямого ковалентного связывания с биолигандами, контролируемые параметры частиц на стадии синтеза, возможность расширения спектра получаемых частиц и их свойств путем сополимеризации со стиролом и последующим введением в них НК позволит использовать их в качестве флуоресцентных носителей биомолекул для дальнейшего использования в разнообразных диагностических тестах (различные виды РЛА, цитофлуориметрия).

Для выбора оптимальной структуры дисперсии на основе акролеина синтезировали разными способами. Полимерные микросферы на основе гомополимеров акролеина получали методами как анионной полимеризации в водно-щелочной среде (ПАА, соотношение фаз 1:20, рН 11, Ткомн.), так и радикальной полимеризации (ПАР, соотношение фаз 1:9, водорастворимый инициатор персульфат калия K2S2O8, Т=65°С). Как видно из данных, представленных в таблице 2, полимерные микросферы обоих типов характеризовались высокой коллоидно-химической стабильностью и низкой растворимостью в органических растворителях (не более 2%), при этом полимерные микросферы с минимальным диаметром и максимальным содержанием альдегидных групп получены методом радикальной полимеризации.

Таблица 2. Характеристики полимерных дисперсий на основе акролеина

№	Тип полиакролеиновых дисперсий	D, нм	Коэффициент вариации, %	C альдегидных групп, мкмоль/г пол.	Устойчивость в 0.2 M NaCl
1.1	ПАА	510	12	26,40	Стаб.
1.2	ПАР	230	8	41,25	Стаб.

Введение гидрофобных НК в полимерные микросферы на стадии синтеза приводило к тушению флуоресценции. Поэтому была разработана методика введения НК в уже синтезированные полимерные дисперсии, которая заключается в предварительном набухании полимерных частиц в органическом растворителе (этанол, изопропиловый спирт), добавлении НК в смеси того же растворителя с хлороформом, удалении растворителя и переводе полученных полимерных микросфер с включенными НК в водную среду.

Рис. 8 Сравнение интенсивности флуоресценции (норм.) полимерных дисперсий ПАА (1) и ПАР(2).

 

Полученные

Флуоресцентные полимерные дисперсии ПАА и ПАР характеризовались высокой степенью включения НК; при примерно одинаковой интенсивности флуоресценции (рис. 8).

Оценку флуоресцентных свойств дисперсий ПАА и ПАР проводили методом флуоресцентной лазерной микроскопии. Для этого дисперсии наносили на кремниевые подложки и высушивали. Флуоресценцию микросфер возбуждали аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 488 нм и мощностью не более 0.01 мВт. Найдено, что включение НК в полиакролеиновые микросферы приводит к смещению пика эмиссии НК в синюю область в зависимости от состава микросфер и параметров НК (в случае НК с λэм.=546 нм – смещение в синюю область на 12 нм, НК с λэм.=583 нм - на 18 нм соответственно). Наиболее вероятной причиной синего сдвига пика эмиссии НК при включении в микросферы является устранение излучающих поверхностных состояний НК с энергией меньше энергии фундаментального перехода, вызванное формированием вокруг НК полимерной оболочки, обусловливающим, кроме того, подавление каналов тушения флуоресценции НК. Последнее, является причиной возрастания интенсивности флуоресценции по сравнению с флуоресценцией исходных НК.