Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов (стр. 6 )

Рис. 18. Стеклянная капсула с Цис - НК (концентрация - 0.003 мг/мл). Внутренний диаметр капсулы 2 мм. Флуоресцентный диффузионный томограф, экспериментальный прибор (ИПФ РАН).

Характеристики прибора: лазерный источник излучения Nd:YAG с удвоением частоты, l = 532 нм, детектор: Hamamatsu H7422-20.

Данный результат показывает, что полученные в работе гидрофилизированные НК могут быть использованы в качестве визуализирующих контрастирующих агентов – маркеров в методе оптической томографии in vivo на глубине 0,5- 1,5 см.

4.5 Цитофлуориметрический анализ

Другой вариант использования флуоресцентных полимерных дисперсий – проточная цитофлуориметрия, позволяющая анализировать спектральные свойства каждой из проходящих через детектор микросферы. Использование спектрально кодированных полимерных микросфер предполагает анализ каждой микросферы для выявления присутствия в анализируемой пробе каждого из детектируемых объектов.

Полимерные дисперсии ПА1-ПС1 и содержащие НК двух типов с максимумами флуоресценции 530 и 610 нм, использовали для мечения и регистрации клеток линии Jurkat (Т-лимфобластной лейкемии) методом проточной цитофлуориметрии. В результате инкубации в течение 20 минут на поверхности клеток Jurkat сорбировалось в среднем 10-15 флуоресцентных полимерных микросфер (рис. 19).

Фон рассеяния немеченых клеток отсекается выбором минимального уровня регистрации по каналу FL3 (605-635 нм) - 1·102 (показан горизонтальной линией). Регистрация сигнала выше этого уровня позволяет выявить клетки, меченные «красными» полимерными микросферами (λэмисс=610 нм). Клетки с адсорбированными на поверхности полимерных микросфер двух цветов λэмисс=610 нм и 530 нм дают примерно одинаковый вклад в оба канала регистрации: FL1 (505-545 нм) и FL3 (605-635 нм). Сигналы от этих клеток выделяются выбором минимальных уровней регистрации по каналам FL1 и FL3 - 5·102 и 1·102 соответственно (показаны вертикальной и горизонтальной линиями).

Таким образом, продемонстрирована возможность использования полимерных дисперсий, содержащих флуоресцентные НК, в цитофлуориметрии.

Рис. 19. Мечение клеток Jurkat флуоресцентными полимерными микросферами ПА1-ПС1: (а) - исходные клетки, (б) – клетки, меченные микросферами, кодированными «красными» НК (λэмисс = 610 нм) и (в) – клетки, меченные микросферами, кодированными смесью «красных» и «зеленых» НК (λэмисс = 610 нм и 530 нм). Клетки анализировали на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter Epics XL (каналы регистрации - FL1 – 505-545 нм; FL3 – 605-635 нм; возбуждение - аргоновый лазер, λвозб. = 488 нм).

5. Получение пленок гидрофильных НК с двумя различными длинами волн флуоресценции на поверхности оптических стекол

Продолжением работ по формированию пленок НК стало формирование пленок гидрофилизированных НК на поверхности оптических стекол. Была разработана методика получения пленок гидрофилизированных НК с двумя различными длинами волн флуоресценции на поверхности покровных стекол, модифицированных поли-L-лизином. Полученные пленки характеризовались плотной упаковкой и высокой пространственной однородностью, что, в конечном счете, определяет стабильность флуоресцентных свойств на макромасштабном уровне при многократном сканировании одного и того же участка.

Полученные в результате пленки флуоресцентных гидрофилизированных НК обладают высоковоспроизводимыми свойствами: отношение сигнального пика флуоресценции к референсному составляет » 1.5±0.1 и не изменяется на макромасштабных расстояниях более чем на 0.2% (рис. 20). Кроме того, такие пленки обладают очень высокой трибологической устойчивостью и не требуют дополнительных защитных покрытий (рис. 21).

Рис. 20. Спектрально – морфологическое исследование тестовых участков покровного стекла с нанесенными пленками из «зеленых» и «красных» гидрофилизированных цистеином НК.

Рис. 21 Демонстрация трибологической устойчивости осажденных на покровное стекло пленок гидрофилизированных НК. Последовательное сканирование одного и того же участка 10 раз подряд, показаны результаты первого и десятого сканирования.

Планируется, что разработанная методика по формированию пленок НК с двумя с двумя различными длинами волн флуоресценции будет в дальнейшем развита для нанесения пленок НК на излучающую апертуру оптоволоконных зондов для сканирующей ближнепольной оптической микроспектроскопии для создания FRET-зондов. - наличие двух достаточно далеко разнесенных полос флуоресценции от НК двух типов позволит проводить не прямое измерение интенсивности флуоресценции, модулируемой взаимодействием донорных НК с исследуемым объектом, а измерение относительных интенсивностей двух пиков флуоресценции - от донорных (взаимодействующих по механизму FRET с исследуемым веществом) и от референсных (не взаимодействующих) НК, что значительно повысит достоверность получаемых результатов.

Выводы

1.  Исследованы свойства и поведение полупроводниковых CdSe/ZnS НК структуры ядро/оболочка в конденсированных средах. Показано, что при предельно высокой плотности НК сохраняется эффект размерного квантования. Показано, что при средних расстояниях между нанокристаллами ниже двух их диаметров, происходит ухудшение их оптических свойств (снижение квантового выхода, смещение положения пика флуоресценции в красную область).

2.  Разработаны способы получения наноразмерных (5-80 нм) дисперсий НК, коллоидно-устойчивых в водных средах и с функциональными группами на поверхности, путем модификации НК синтетическими и природными полимерами. Показано, что наилучшие результаты, как в плане коллоидной стабильности, так и с точки зрения флуоресцентных свойств дает методика модификации амфифильными полимерами (без удаления стабилизирующего лиганда с поверхности НК).

3.  Разработана методика получения флуоресцентных полимерных микросфер на основе гомо - и сополимеров акролеина с размерами в диапазоне 100-500 нм.. Показана предпочтительность использования микросфер на основе сополимеров акролеина и стирола, заключающаяся в возможности практически полного и надежного внедрения НК в полимерную матрицу. Методика позволяет формировать стабильные в различных средах микросферы, сохраняющие флуоресцентные свойства и не выделяющие НК в окружающую среду.

4.  Разработана методика введения НК в микросферы из этилцеллюлозы. Показано, что в случае гидрофобных НК, полимерная матрица модифицирует поверхность НК, что проявляется в изменении оптических свойств НК.

5.  Продемонстрирована возможность введения в полимерные микросферы НК с различными длинами волн флуоресценции и смесей НК разных цветов для многоцветного оптического кодирования полимерных дисперсий, при возбуждении флуоресценции одним монохроматическим источником.

6.  Показано, что разработанные способы модификации НК – модификация синтетическими и природными полимерами, а также включение в полимерную матрицу - приводят к изменению флуоресцентных свойств НК: увеличению квантового выхода и смещению положения пика эмиссии НК.

7.  Разработаны способы получения серии биоаналитических реагентов путем иммобилизации различных биолигандов на частицы водных дисперсий НК, а также на полимерные микросферы с включенными НК. На примерах реакции латексной агглютинации, иммунофлуоресцентного мечения и визуализации клеток и клеточных рецепторов, проточной цитофлуориметрии продемонстрирована возможность использования полученных флуоресцентных реагентов в биоанализе.

8.  Разработан способ получения пленок - прототипов FRET-зондов на основе гидрофилизированных НК с двумя различными длинами волн испускаемой флуоресценции, обладающих воспроизводимыми флуоресцентными свойствами и высокой трибологической устойчивостью.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

Chistyakov А. A., Martynov I. L., Mochalov K. E., Oleinikov V. A., Sizova S. V., Ustinovich E. A., Zakharchenko K. V. Interaction of CdSe/ZnS Core–Shell Semiconductor Nanocrystals in Solid Thin Films, Laser Physics, 2006, Vol. 16, No. 12, pp. 1625–1632. , , Синтез субмикронных сополимерных (акролеин/стирол) микросфер, содержащих флуоресцентные полупроводниковые CdSe/ZnS нанокристаллы. Российские нанотехнологии, 2007, т.2, №7-8, стр. 144-154. , , Модификация твердых материалов полимерными нанослоями как способ получения новых биоматериалов. Высокомолекулярные соединения, Серия А, т. 49, № 12, 2007, стр. 2042-2062. Generalova A. N., Sizova S. V., Oleinikov V. A., Zubov V. P., Artemyev M. V., Spernath L., Kamyshny A., Magdassi Sh. Highly Fluorescent Ethyl Cellulose Nanoparticles Containing Embedded Semiconductor Nanocrystals. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2009, Vo. 342, Issues 1-3, pp. 59-64. , , Полиакролеиновые латексы, содержащие (CdSe)ZnS нанокристаллы, для флуоресцентного мечения биологических объектов, Международная конференция «Лазерная физика и оптические технологии». Гродно, Белоруссия, 25-29 сентября, 2006. , , Метод флуоресцентной диффузионной томографии для визуализации опухолей, меченых квантовыми точками. Труды VIII Международной конференции «Опто-, наноэлектроника, нанотехнологии и микросистемы», Ульяновск, 26-30 июня, 2006, стр. 241. Generalova A. N., Sizova S. V., Zubov V. P. Labeled polymer particles. 1st NACBO International Nanobiotechnology Conference “New materials in nanobiotechnology and its applications”. Urbino, Italy, 11-13 september, 2006. Sizova S. V., Generalova A. N., Zubov V. P., Semiconductor Nanocrystals (CdSe)ZnS modification with functioanalized polymers. 1st NACBO International Nanobiotechnology Conference “New materials in nanobiotechnology and its applications”, Urbino, Italy, 11-13 September, 2006. Сизова C. В., , Получение полимерно-капсулированных (CdSe)ZnS нанокристаллов для использования в биоанализе. Российская школа-конференция молодых ученых «Биосовместимые наноструктурные материалы и покрытия медицинского назначения». 25 сентября-1 октября, Белгород, 2006, стр. 242. , , Новые флуоресцентные полимерсодержащие реагенты для биоанализа. ХVIII менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Тезисы докладов, Москва, 23-28 сентября, 2007 г., т.2, стр. 518. , , Зубов полимерные реагенты для биоанализа, содержащие флуоресцентные полупроводниковые CdSe(ZnS) нанокристаллы. В сб. III Международная конференция по коллоидной химии и физико-химической механике, Москва, 24-28 июня, 2008. , , Олейников сополимерные частицы для биоанализа, содержащие инкапсулированные полупроводниковые нанокристаллы. В сб. III Международная конференция по коллоидной химии и физико-химической механике, Москва, 24-28-июня, 2008, с.57. , , Олейников полимерные конъюгаты полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов для биотехнологии. Пятый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Материалы конгресса. Москва, 16-20 марта, 2009, стр. 484.