Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов (стр. 5 )

(б) Сравнение интенсивностей флуоресценции МУК-НК, включенных в ЭЦ частицы (1) и исходных МУК-НК (2).

Стоит отметить, что оба подхода позволяют получить флуоресцентные частицы на основе этилцеллюлозы, при этом способ введения гидрофобных НК в ЭЦ частицы приводит к большему приросту квантового выхода по сравнению с методом включения гидрофилизированных НК в ЭЦ частицы.

Введение НК в полимерную матрицу как из этилцеллюлозы, так и из полимеров на основе акролеина привело к увеличению квантового выхода и, следовательно, к подавлению каналов тушения флуоресценции НК. Кроме того, подавлением каналов тушения можно частично или полностью устранить флуктуации флуоресценции одиночных НК, которые весьма нежелательны при разработке многоцветных флуоресцентных реагентов для высокочувствительной визуализации в биоанализе, и таким образом стабилизировать сигнал флуоресценции.

Таким образом, получена серия флуоресцентных полимерных носителей на основе гомо - и сополимеров акролеина, а, также на основе наночастиц из этилцеллюлозы, содержащих полупроводниковые НК. Широкий диапазон диаметров частиц (100-500 нм), высокая интенсивность флуоресценции полученных флуоресцентных полимерных дисперсий, фотостабильность, возможность в широких пределах варьировать цвет флуоресценции, используя при этом монохроматический источник возбуждения, открывают широкие возможности их использования в различных видах биоанализа.

Перечень разработанных типов флуоресцентных полимерных носителей и их характеристики приведены в сводной таблице 4.

Таблица 4. Характеристики флуоресцентных полимерных дисперсий

№	Тип полимерных дисперсий	Функциональные группы на поверхности	Средний диаметр частиц, нм	Коэф-т вариации, %
2.1	ПАА	СНО	510	12
2.2	ПАР	СНО	230	8
2.3	ПА1-ПС1	СНО	420	7
2.4	ПА5-ПС1	СНО	250	11
2.5	ПА10-ПС1	СНО	145	8
2.6	ЭЦ	ОН	211	10

4. Примеры использования флуоресцентных полимерных частиц в биоанализе

4.1 Использование флуоресцентных полимерных микросфер в РЛА

Полученные флуоресцентные полимерные микросферы, содержащие альдегидные группы, которые могут вступать в реакции с белками, представляют большой интерес для использования в качестве флуоресцентных носителей в различных видах биоаналитических тестов, основанных на специфическом высокоаффинном взаимодействии между детектируемым лигандом и реагентом, содержащим антилиганд, к которому могут быть отнесены реакции «антиген-антитело», «биотин-стрептавидин», «углевод-лектин», «иммуноглобулин-белок А», «транспортный белок-рецепторный белок», «холестерин-дигитонин», «комплементарные олиго - и полинуклеотид» и др. Существуют различные методы проведения анализов с участием полимерных микрочастиц, такие как РЛА в планшете, на стекле, на фильтре, в объеме, стрип-тесты, микрочипы и т. д.

Нами была разработана единообразная методика получения конъюгатов полимерных флуоресцентных микросфер разного размера с антителами и пептидными лигандами и получена серия конъюгатов с моноклональными антителами к антигену Y.pestis, антителами IgG человека к ревматоидному фактору, антителами IgG человека к L.monocytogenes 1-й и 2-й серогрупп и т. д. Иммунохимическую активность полученных реагентов определяли с помощью РЛА в планшете как наиболее простом и хорошо отработанном методе регистрации результата взаимодействия антител и антигена.

В качестве примера приведены результаты РЛА с использованием конъюгатов флуоресцентных микросфер ПА1-ПС1 (2.1, табл. 4) с моноклональными антителами к антигену Y.pestis (рис. 15). Найдено, что при использовании ПА1:ПС1, наполненных НК, и концентрации добавленных антимг/мл, минимально детектируемая концентрация составляет 15 нг/мл, что несколько ниже чувствительности иммуноферментного анализа, в целом, более трудоемким по сравнению с процедурой проведения РЛА. Время проведения РЛА составляет не более 2 ч.

Рис. 15. Результаты РЛА флуоресцентных сополимерных микросфер ПА1:ПС1 с включенными НК (диаметр ядра CdSe 3,7 нм). Микросферы сенсибилизированы моноклональными антителами к Y.pestis (0,8 мг/г полимера). 1-й ряд - реакция агглютинация при добавлении антигена Y.pestis (начальная концентрация антигена 1 мг/мл). 2-й ряд – отрицательный контроль – при добавлении нормальной кроличьей сыворотки.

Флуоресцентные наночастицы на основе этилцеллюлозы с диаметром частиц 200 нм (2.6, табл. 4) тестировали в РЛА на стекле. Анализ, основанный на реакции пассивной агглютинации на стекле, позволяет быстро, в течение нескольких минут, дать ответ о присутствии детектируемого антилиганда. На поверхность флуоресцентных этилцеллюлозных частиц иммобилизовали моноклональные антитела к антигену Y. pestis. Антитела добавляли в количестве от 3 до 10 мг/г полимера. Результаты реакции РЛА в УФ-свете показали, что чувствительность анализа составляет 5 мкг/мл, а время проведения анализа не превышает 5 мин.

4.2 Иммунофлуоресцентное мечение клеток полимерными микросферами, наполненными НК

Для анализов, связанных с визуализацией специфических рецепторов на поверхности клеток, необходимо использовать флуоресцентные полимерные носители-маркеры, диаметр которых не превосходит 250 нм. Этому критерию соответствуют флуоресцентные полимерные микросферы ПА10:ПС1 (2.5, табл. 4) с включенными НК с λэм=610 нм. Указанные микросферы конъюгировали с мини-анителами 4D5scFv-His5, взятыми в различных концентрациях, для визуализации онкомаркера HER2/neu, гиперэкспрессирующегося на поверхности многих раковых клеток (при раке молочной железы, предстательной железы, яичника, желудка, легких). Ранняя диагностика HER2/neu, гиперэкспрессия которого ассоциирована со злокачественными опухолями и неблагоприятным прогнозом у пациентов, является в настоящее время одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. После обработки полученными конъюгатами клеток SKBR-3, гиперэкспрессирующих онкомаркер HER2/neu, наблюдалось характерное свечение клеток, причем интенсивность флуоресценции коррелировала с концентрацией антител в образцах (рис.16).

После инкубации клеток с полимерными частицами, конъюгированными с овальбумином в тех же концентрациях, флуоресцентного свечения клеток не наблюдалось (рис.16). Таким образом, связывание полимерных частиц, конъюгированных с мини-анителами 4D5scFv-His5 с HER2/neu-гиперэкспрессирующими клетками является специфическим, и полученные конъюгаты могут быть использованы для мечения и визуализации опухолевых клеток.

Рис. 16. Микрофотографии клеток SKBR-3, меченные флуоресцентными полимерными микросферами ПА10-ПС1, конъюгированными с 4D5-His5.

Концентрация 4D5scFv-His5 в конъюгирующей смеси 0.425 мкг/мл 5% дисперсии (1) и 0.085 мкг/мл (2), (3) – контроль, клетки SKBR-3, меченные флуоресцентными полимерными микросферами ПА10-ПС1, конъюгированными с овальбумином.

4.3 Иммунофлуоресцентное мечение клеток НК, модифицированных тиолсодержащими молекулами

НК, модифицированные тиолсодержащими молекулами, были испытаны как флуоресцентные маркеры для визуализации комплекса “лиганд-антилиганд”. Малый размер таких частиц (5-10 нм) даст возможность применять их в анализах in vitro и in vivo для мечения и визуализации клеток и клеточных рецепторов.

НК, модифицированные цистеином (Цис-НК) были использованы для специфического мечения клеток и идентификации онкомаркера HER2/neu в лаборатории молекулярной иммунологии ИБХ РАН (член-корр. РАН ). Цис-НК конъюгировали с белком барстаром методом карбодиимидной активации карбоксильных групп. Тест был выполнен на клетках человеческой аденокарциномы яичника линии SKOV-3 (рис. 17). После предварительной обработки клеток 4D5scFv-барназа-His5 полученные конъюгаты гидрофилизированных цистеином НК с барстаром с высокой специфичностью окрашивали поверхность HER2/neu - гиперэкспрессирующих клеток линии SKOV-3.

Рис. 17. Микрофотографии клеток SKOV-3, окрашенных конъюгатом барстар - Цис-НК.

а – SKOV-3, меченные конъюгатом барстар - Цис-НК после обработки клеток 4D5scFv-барназа-His5. б – Контроль – SKOV-3, меченные конъюгатом барстар-Цис-НК.

Полученные результаты свидетельствуют о специфичности взаимодействия полученных конъюгатов, а также демонстрируют потенциальную возможность использования таких НК для визуализации опухолевых клеток, экспрессирующих онкомаркер HER2/neu.

4.4 Визуализация объектов внутри биологических тканей методом флуоресцентной оптической диффузионной томографии

Уникальные оптические свойства полупроводниковых НК, такие как фотостабильность и широкий диапазон полос флуоресценции в зависимости от диаметра ядра НК, в том числе и в ближнем инфракрасном диапазоне, делают их привлекательными для использования в качестве in vivo маркеров при визуализации глубоко расположенных тканей и органов. С целью определения принципиальной возможности детекции НК методом ФДТ гидрофилизированные цистеином НК с максимумом флуоресценции 620 нм в диапазоне концентраций 0.003-0.3 мг/мл запаивали в стеклянную капсулу и помещали в пищевод животных (имитация детекции опухоли, контрастированной мечеными НК лигандами, имеющими высокую афинность к рецепторам на поверхности опухолевых клеток). Исследуемый объект сканировали в конфигурации «на просвет» лазерным источником излучения во флуоресцентном оптическом диффузионном томографе (ФДТ-установке), разработанном в лаборатории биофотоники ИПФ РАН под руководством к. ф.-м. н. . В результате методом флуоресцентной оптической диффузионной томографии были получены изображения капсул с высоким контрастом, что хорошо видно на рис. 18.