Биохимия (стр. 6 )

Результаты занести в таблицу 7. Сделать вывод об оптимальной температуре для действия исследуемого фермента.

Таблица 7

№	Субстрат	Фермент	Температура	Реакция на крахмал с йодом	Реакция Троммера	ВЫВОД
1.
2.
3.
4.

Лабораторная работа №14

ВЛИЯНИЕ РЕАКЦИИ СРЕДЫ НА ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ СЛЮНЫ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Каждый фермент наиболее активен в пределах довольно узкой зоны рН (оптимум рН). При изменении рН в любую сторону от оптимального значения активность фермента уменьшается. Отклонение рН от оптимума может нарушать связь между белковой частью ферментов и их простетическими группами, может влиять на связывание субстрата с ферментов. Оптимум рН для амилазы слюны равен 6,9.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) слюна в разведении 1:100 (1:50); 2) крахмал, 0,5 % раствор; 3) Na2HPO4, 0,2 М раствор; 4) лимонная кислота, 0,1 М раствор; 5) раствор 0,1 % йода в 0,2 % йодистом калии; 6) NaCl, 1 % раствор; 7) микробюретки; 8) водяная баня или термостат (температура 38о); 9) пипетки на 1 мл.

ХОД РАБОТЫ:

В 7 пронумерованных пробирок наливают 0,2 М раствор Na2HPO4 и 0,1 М раствор лимонной кислоты в соотношениях, указанных в таблице 9. Получают буферные растворы с рН от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 1 % раствора NaCl и 0,5 % раствора крахмала, по 10 капель слюны, разведенной в 50 или 100 раз (согласно таблице 8).

Таблица 8

Определение оптимума рН действия амилазы слюны

№	Кол-во 0,2 М Na2HPO4 (мл)	Кол-во 0,1 М лимонной кислоты	рН	Кол-во 0,5 % р-ра крахмала (капли)	Кол-во слюны 1:100 (1:50), капли
1.	0,58	0,42	5,6	10	10
2.	0,63	0,37	6,0	10	10
3.	0,69	0,31	6,4	10	10
4.	0,77	0,23	6,8	10	10
5.	0,87	0,13	7,2	10	10
6.	0,94	0,06	7,6	10	10
7.	0,97	0,03	8,0	10	10

Содержимое пробирок перемешивают и помещают их в водяную баню или термостат при температуре 38о на 8 минут.

Затем во все пробирки добавляют по 1 капле раствора йода в йодистом калии, перемешивают, наблюдают окраску и определяют рН, при котором амилаза действует наиболее активно (оптимальную рН).

Результат занести в таблицу 9. Сделать вывод об оптимуме рН действия амилазы слюны.

Таблица 9

№	рН	Окраска с йодом	ВЫВОД
1
2
3
4
5
6
7

Лабораторная работа №15

ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ И ИНГИБИТОРОВ

НА ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ

Вещества, усиливающие действие ферментов, называются активаторами. Активаторы стимулируют действие ферментов, но в отличие от коферментов не принимают участия в реакции.

Ингибиторами (парализаторами) называются вещества, снижающие скорость ферментативных реакций. Ингибирование действия ферментов может происходить в том случае, если с активным центром фермента вместо специфического субстрата соединяется близкий структурный аналог субстрата, т. е. вещество, близкое по строению к субстрату (конкурентное торможение). Ингибиторами нередко являются продукты промежуточных или конечных реакций какого-либо биохимического процесса.

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Активность амилазы слюны усиливается в присутствии хлористого натрия – специфического активатора амилазы. Сернокислая медь оказывается тормозящее действие на активность амилазы. Крахмал и декстрины открывают реакцией с раствором йода.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) слюна в разведении 1:5; 2) крахмал, 1 %; 3) NaCl, 1 %; 4) CuSO4, 1 %; 5) 0,1 % раствора йода в 0,2 % йодистом калии; 6) пробирки.

ХОД РАБОТЫ:

В 3 пронумерованные пробирки приливают по 3 мл слюны, разведенной 1:5.

В пробирку №1 добавляют 2 капли 1 % раствора NaCl.

В пробирку №2 добавляют 2 капли 1 % раствора CuSO4.

В пробирку №3 (контрольная) добавляют 2 капли дистиллированной воды.

Затем во все три пробирки приливают по 5 капель 1 % раствора крахмала.

Оставляют на 2 минуты при комнатной температуре. После чего проделывают реакцию на крахмал, приливая по 1 капле раствора йода в йодистом калии.

Результат занести в таблицу 10. Сделать вывод о том, какое из добавленных веществ является активатором, а какое – ингибитором.

Таблица 10

№	Субстрат	Фермент	Добавленное вещество	Окраска с йодом	ВЫВОД
1.
2.
3.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

При каких оптимальных условиях следует определять активность ферментов?

Как влияет рН на активность ферментов?

Как можно оценить специфичность ферментов?

Как можно воздействовать на скорость ферментативной реакции?

Как зависит скорость ферментативной реакции от концентрации субстрата?

Как влияют активаторы и ингибиторы на действие ферментов?

Конкурентные и неконкурентные ингибиторы. Механизм их действия.

Ингибиторы необратимого действия.

Регуляция активности ферментов. Единица активности.

Напишите уравнение реакции гидролиза крахмала до глюкозы под влиянием ферментов слюны.

Напишите уравнение химической реакции Троммера с глюкозой.

Тема 7

ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ ОТДЕЛЬНЫХ КЛАССОВ

Катализируемая химическая реакция является тем признаком, по которому можно отличить один фермент от другого. Этот принцип был положен в основу классификации ферментов, согласно которой все известные ферменты подразделяют на шесть классов.

v  ЗАДАНИЕ: заполнить таблицу 11.

Таблица 11

№	Класс	Реакции, катализируемые ферментом	Важнейшие подклассы	Примеры
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Лабораторная работа №16

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕПСИНА

Ферменты пищеварительного тракта, ускоряющие переваривание белков, жиров и углеводов пищи, относятся к классу гидролаз. Ферменты, принимающие участие в расщеплении белков в желудочно-кишечном тракте, относятся к подклассу пептид-гидролаз. Особенностью пепсина является то, что он максимально активен в резко кислой среде (оптимум рН 1,0-2,0).

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Створаживание молочно-ацетатной смеси при рН 4,9 и температуре 25 ºС пепсином происходит в соответствии с его способностью переваривать белки. За единицу активности пепсина принимают такое его количество, которое при указанных условиях створаживает 5 мл молочно-ацетатной смеси за 1 мин (эта условная единица соответствует 0,01 мг кристаллического пепсина). В норме желудочный сок человека содержит в 1 мл 40-60 ед. пепсина.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) ацетатный буфер с рН 4,9; 2) молочно-ацетатная смесь; 3) раствор пепсина или желудочный сок; 4) пробирки, пипетки, секундомер.

ХОД РАБОТЫ:

В пробирку №1 помещают 1 мл желудочного сока (или раствора пепсина).

В пробирку №2 – 3 мл молочно-ацетатной смеси и прогревают 5 минут при 25 ºС. Затем быстро переливают молочно-ацетатную смесь в первую пробирку и включают секундомер. Как только на стенках пробирки появятся первые хлопья казеина, останавливают секундомер. Для расчета активности пепсина в 1 мл число 60 делят на количество секунд – получают количество единиц пепсина в 1 мл желудочного сока.

Например, 40 ед. соответствует 0,4 мг кристаллического пепсина.

Результат занести в таблицу 12.

Таблица 12

№	Фермент	Субстрат	Реакция, катализируемая ферментом	Время действия	Количество пепсина в 1мл

Лабораторная работа №17

ДЕЙСТВИЕ ПЕПСИНА НА БЕЛОК ФИБРИН