Роль полиморфизма и уровня экспрессии генов цитокиновой сети в формировании молекулярно-генетических основ предрасположенности к эссенциальной гипертензии (стр. 2 )

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования. Обследовано 355 больных ЭГ (298 мужчин, 57 женщин) с длительностью заболевания более года (средний возраст больных на момент обследования составил 53.29±7.85 лет). Диагноз ЭГ устанавливался с учетом Национальных рекомендаций по профилактике, диагностике и лечению артериальной гипертонии второго пересмотра (2004). Обследование проводилось на базе ГУЗ «Республиканский кардиологический диспансер» (главный врач , г. Уфа). Клиническая группа состояла из трех подгрупп. Первая включала 219 больных неосложненной ЭГ (162 мужчины, 57 женщин), в возрасте от 30 до 65 лет (средний возраст 51.92±7.79 лет). Вторую подгруппу составили 95 мужчин, больных ЭГ, с постинфарктным кардиосклерозом (средний возраст 55.71±8.84 лет). Заключение о перенесенном ИМ выносилось ретроспективно, по данным амбулаторных карт и выписок, на основании критериев Комитета экспертов ВОЗ (1978). В третью подгруппу входил 41 мужчина, страдающий ЭГ, перенесший ишемический инсульт (средний возраст 53.98±7.45 лет). Заключение о перенесенном инсульте также выносилось по данным амбулаторных карт и выписок, согласно критериям ВОЗ, с учетом данных компьютерной и магнитно-резонансной томографии. Контрольная группа составлена из 273 практически здоровых людей (182 мужчины, 91 женщина), без признаков сердечно-сосудистых и других хронических заболеваний. Группы пациентов и контрольная были этнически однородны.

Методы исследования.

Клиническое обследование. Все больные прошли обследование, которое включало сбор жалоб и анамнеза, физикальное обследование, общий и биохимический анализ крови и мочи, ЭКГ в 12 стандартных отведениях, проведение эхокардиографического и доплеровского исследования, а также велоэргометрии и холтеровского мониторирования по показаниям, антропометрическое обследование с определением индекса массы тела (ИМТ) по формуле: ИМТ (кг/м2)=Вес(кг)/Рост(м)2 [Pyorala K., 1994].

Всем больным проводилось вычисление массы миокарда ЛЖ по корригированной формуле ASE: ММЛЖ=0.8x1.04x[(КДР+МЖП+ТЗС)3-КДР3)]+0.6, индекса относительной толщины стенок в диастолу (ИОТ=(МЖП+ТЗС)/КДР) [, 2003] и индекса массы миокарда (ИММ ЛЖ=ММЛЖ/ППТ, где ППТ (м2) – площадь поверхности тела, определяемая по формуле: ППТ=0.007184хВес(кг)0.425хРост(см)0.725) [Dubois D., 1976]. Также вычисляли конечный диастолический (КДО ЛЖ, мл) и конечный систолический (КСО ЛЖ, мл) объем по формуле: V=7xD3/2.4+D, где D-КДР ЛЖ или КСР ЛЖ, соответственно [, 2002]. Объем миокарда левого желудочка (Vm) ЛЖ (см3) рассчитывали по формуле: VmЛЖ= 1.047х(КДР ЛЖ+ТЗС ЛЖ во время диастолы)3-1,047хКДР ЛЖ3 [, 2002]; общий объем (ОО) ЛЖ (см3): ОО ЛЖ = КДО ЛЖ+Vm ЛЖ [, 2002], конечно-диастолический индекс (КДИ): КДИ = КДО/ППТ; индекс конечного диастолического размера (ИКДР): ИКДР= КДР/ППТ [, 2004].

За критерий гипертрофии левого желудочка принимался показатель ИММ ЛЖ, превышающий 117 г/м2 у мужчин, 104 г/м2 у женщин [de Simone, 2007]. На основании значении ИММ и ИОТ выделяли следующие типы ремоделирования миокарда: I тип – нормальная геометрия (ОТСМЖП≤ 0.45 и ОТСЗСЛЖ≤0.45), II тип – концентрическое ремоделирование (ОТСМЖП>0.45 и ОТСЗСЛЖ>0.45), III тип – изолированная гипертрофия МЖП (ОТСМЖП>0.45 и ОТСЗСЛЖ≤0.45), IV тип – изолированная гипертрофия ЗС ЛЖ (ОТСМЖП≤0.45 и ОТСЗСЛЖ>0.45), V тип – концентрическая гипертрофия (ИММ>117 г/см2 и ИОТ >0,45), VI тип – эксцентрическая гипертрофия без дилатации полости ЛЖ (ИММ>117 г/см2, ИОТ<0.45, ИКДР<3.1), VII тип – эксцентрическая гипертрофия с дилатацией полости ЛЖ (ИММ>117 г/см2, ИОТ<0.45, ИКДР>3.1).

Молекулярно-генетический анализ. ДНК выделяли из цельной венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew M. et al., 1984]. Суммарную РНК выделяли из периферической крови с использованием набора AquaPure RNA Isolation Kit компании Bio-Rad в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Комплементарную ДНК получали из 3-5 мкг суммарной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием oligo(dT)12-18 праймера (Синтол, Россия) и обратной транскриптазы М-MuLV (MBI Fermentas, США). Количественную ПЦР в реальном времени проводили в приборе iCycler iQTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США). Для определения уровня мРНК использовали микроматрицы, содержащие праймеры к 84 генам цитокинов и их рецепторов (RT2ProfilerTM PCR Array, SuperArray Bioscience Corporation, США), а также RT2 SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix.

Анализ генетического полиморфизма осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия). Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле с последующим окрашиванием раствором бромистого этидия и визуализацией в УФ-свете.

Методы статистического анализа результатов исследования. Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0, программного обеспечения MS Exel 98 (Мicrosoft) и компьютерной программы RxS (Rows x Columns) [Roff P. A. et al., 1989]. Частоты генотипов и аллелей сравнивали с использованием точного двустороннего критерия Фишера. Относительный риск заболевания (OR, соотношение шансов, odds ratio) вычисляли по формуле J. Bland (2000). Соответствие наблюдаемого распределения значений количественных показателей нормальному закону распределения оценивалось с использованием критерия Шапиро-Уилка. При сравнении групп по количественному признаку в случае соответствия его нормальному распределению использовался t-критерий Стьюдента для независимых групп, равенство дисперсий распределений признаков проверялось при помощи критерия Левена, в противном случае применялся U-критерий Манна-Уитни [ 1999; , 2002].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структура факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний у больных ЭГ

Больные, включенные в исследование, были подразделены на четыре группы в зависимости от пола и наличия ассоциированных клинических состояний (АКС), к которым были отнесены инфаркт миокарда и ишемический инсульт.

Согласно результатам анализа клинических, антропометрических и демографических данных, исследуемые группы однородны по таким параметрам, как средний возраст манифестации заболевания, семейная отягощенность по сердечно-сосудистым заболеваниям, наличию факторов риска (курение и употребление алкоголя), а также показателям артериального давления и частоты сердечных сокращений (табл. 1).

При анализе липидного профиля сыворотки крови установлено, что у женщин, больных ЭГ, в сравнении с мужчинами, выше уровень общего холестерина (6.03±1.42 ммоль/л и 5.17±1.25 ммоль/л, Р<0.001). По остальным показателям липидного спектра кровистатистически значимых различий не выявлено.

Таблица 1

Клиническая характеристика больных ЭГ

Показатель (M±SD)*	Мужчины	Женщины
ЭГ	ЭГ+ИМ	ЭГ+инсульт	ЭГ
N**	162	95	41	57
Средний возраст, лет	52.92±6.74	50.00±6.30	54.83±7.05	57.22±9.11
Средний возраст манифестации ЭГ, лет	43.16±8.32	45.67±10.12	42.19±8.89	41.62±9.98
Отягощенность анамнеза по АГ по ИБС АГ+ИБС	31 (19.14%) 24 (14.81%) 9 (5.55%)	18 (18.95%) 15 (15.79%) 7 (7.37%)	9 (21.95%) 8 (19.51%) 2 (4.88%)	12 (21.05%) 8 (14.04%) 4 (7.02%)
Курение	35 (21.60%)	27 (28.42%)	9 (21.95%)	2 (3.51%)
Алкоголь	37 (22.84%)	25 (26.36%)	6 (14.63%)	2 (3.51%)
Курение + алкоголь	8 (4.94%)	9 (9.47%)	1 (2.44%)	0 (-)
АД сис (мм. рт. ст) АД диаст (мм. рт. ст) АД ср (мм. рт. ст)	147.30±17.62 91.56±10.10 110.14±11.71	148.03±21.91 91.98±11.26 110.20±14.00	148.33±9.83 92.50±6.12 111.11±6.55	150.00±22.62 91.75±10.84 111.17±14.12
ЧСС (уд/мин)	79.07±11.13	78.23±11.39	76.13±10.03	78.73±9.74
ИМТ До 25 кг/м2 От 25 кг/м2 до 30 кг/м2 От 30 кг/м2 и выше	27.74±3.85 68 (41.98%) 59 (36.42) 35 (21.60%)	27.18±3.18 27 (28.42%) 52 (54.74%) 16 (16.84%)	27.79±4.79 14 (34.15%) 20 (48.78%) 7 (17.07%)	29.66±4.21 10 (17.54%) 25 (43.86%) 22 (38.60%)
Холестерин (ммоль/л)	5.17±1.25	5.14±1.18	5.18±1.05	6.03±1.42

Примечание:* M±SD – среднее значение±стандартное отклонение, **N – численность групп

Состояние внутрисердечной гемодинамики и ремоделирование миокарда у больных ЭГ, перенесших ИМ, и больных неосложненной ЭГ

Установлено, что у больных ЭГ, перенесших ИМ, имеются более значимые изменения эхокардиографических показателей, чем у больных неосложненной ЭГ.

В результате сравнения структурно-геометрических показателей у больных двух групп (ЭГ и ЭГ+ИМ) выявлено преобладание процессов дилатации левого желудочка у больных, перенесших ИМ. В данной группе пациентов по сравнению с больными неосложненной ЭГ, не обнаружено значимого увеличения ММЛЖ и ИММ ЛЖ, но наблюдается уменьшение толщины задней стенки левого желудочка, а также снижение индекса относительной толщины миокарда.

Таблица 2

Анализ изменений структурно-геометрических показателей сердца и внутрисердечной гемодинамики у больных ЭГ

Показатель	ЭГ	ЭГ+ИМ	P
КДР ЛЖ, см.	5.07±0.54	5.54±0.82	<0.001
КСР ЛЖ, см.	3.51±0.58	4.10±1.02	<0.001
ПЖ, см.	2.02±0.49	2.22±0.55	0.02
ЛП, см.	3.63±0.44	4.15±0.69	<0.001
МЖП, см.	1.15±0.14	1.13±0.22	0.38
ТЗС, см.	1.12±0.14	1.06±0.14	0.002
ФВ, %	58.52±6.70	48.83±13.61	<0.001
ФУ, %	33.15±6.24	26.74±8.50	<0.001
УО, мл.	73.89±18.58	73.17±17.29	0.22
КДО ЛЖ, мл.	123.93±31.28	154.19±54.98	<0.001
КСО ЛЖ, мл.	53.39±22.24	81.26±49.99	<0.001
Масса ЛЖ, г.	223.41±53.91	247.19±74.43	0.11
ИММ ЛЖ, гр/м2.	115.58±27.71	130.76±40.15	0.01
Vm ЛЖ, см3.	112.82±27.99	126.07±43.92	0.11
ОО ЛЖ, см3.	236.75±56.03	280.26±95.93	0.002
КДИ	64.28±16.84	81.63±29.47	<0.001
ИКДР	2.63±0.33	2.93±0.48	<0.001
ИОТ	0.45±0.06	0.40±0.08	<0.001

В группе больных ЭГ, перенесших ИМ, выявлены также изменения гемодинамических показателей: значительное снижение ФВ и ФУ. Тем не менее, уменьшения УО в указанной группе по сравнению с больными неосложненной ЭГ, не наблюдалось, возможно, за счет увеличения КДО ЛЖ.